Utarbeidelse av Intakt Bovine Tail mellomvirvelskiver for orgel Kultur
Summary
Denne protokollen illustrerer en høsting teknikk for Senen ved halebeinet bovine intervertebral plater for orgel kultur for<em> In vitro</em> Organ kultur.
Abstract
Den intervertebral plate (IVD) er felles for ryggraden koble vertebra til vertebra. Det fungerer å overføre lasting av ryggraden og gi fleksibilitet til ryggraden. Det komponerer av tre avdelinger: den innerste kjernen pulposus (NP) som omfatter ved ringrommet fibrosus (AF), og to cartilaginous gavlene forbinder NP og AF til vertebralis kroppen på begge sider. Discogenic smerter muligens forårsaket av degenerative intervertebral plate sykdom (DDD) og plate herniations har blitt identifisert som et stort problem i vårt moderne samfunn. For å studere mulige mekanismer for IVD degenerasjon, er in vitro orgelkultur systemer med live-plate cellene svært tiltalende. In vitro kultur intakt storfe Senen ved halebeinet IVDs har avansert til en relevant modell system, som gjør studiet av mekano-biologiske aspekter i et godt kontrollerte fysiologiske og mekaniske miljø. Bovine hale IVDs kan skaffes relativt enkelt i høyere tall end er svært lik den menneskelige lumbar IVDs med hensyn til celle tetthet, celle befolkning og dimensjoner. Imidlertid feilet forrige storfe caudal IVD høsting teknikker beholde cartilaginous gavler og beinete gavlene etter 1-2 dager med kultur siden ernæring banene var tydeligvis blokkert av levret blod. Er IVDs de største avascular organer, og dermed næringsstoffer til cellene i NP er utelukkende avhengig av diffusjon gjennom kapillære knopper fra tilstøtende ryggvirvel kroppen. Tilstedeværelse av bein rusk og levret blod på gavl overflater kan hindre næringsstoffer diffusjon inn i midten av platen og kompromiss celleviabilitet. Vår gruppe etablert en relativt rask protokoll for å "knekke"-ut IVDs fra halen med en lav risiko for forurensning. Vi er i stand til permeabilize den ferske snitt bony gavl overflater ved hjelp av et kirurgisk jet lavage system, som fjerner blodpropper og skjæring rusk og svært effektivt gjenåpner ernæring diffusjon veientil midten av IVD. Tilstedeværelsen av veksten plater på begge sider av ryggvirvel bein må unngås, og må fjernes før til kultur. I denne videoen, skissere vi de viktigste trinnene under forberedelse og demonstrere nøkkelen til en vellykket orgelkultur opprettholde høy celleviabilitet i 14 dager under fri hevelse kultur. Kulturen tiden kan utvides når det er hensiktsmessig mekanisk miljø kan opprettholdes ved bruk av mekanisk belastning bioreaktor. Teknikken vist her kan utvides til andre dyrearter som svin, sau og leporine caudal og lumbar IVD isolasjon.
Protocol
Discussion
Det første skrittet for vellykket organ kultur er å sørge for at eksplantering ikke skal bli forurenset. Halen skal være flådd før du starter med prosedyren. Eventuelle dyrehår brakt inn et sterilt laboratorium kan være problematiske i forhold til forurensning. Den bovine halen bør ideelt sett være så ferske som mulig (dette påvirker initial celleviabilitet). Videre er betadine vasketrinn anbefales for å redusere risikoen for smitte videre. I stedet for å bruke en skreddersydd blad holderen og en hammer ti…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette prosjektet ble støttet av den sveitsiske National Science Foundation (SNF # 310030-127586/1).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fresh bovine intervertebral disc tissue from bovine tails, from local slaughter house (ideally within hours post-mortem and without skin). | |||
| Pulsavac Plus AC System | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-486-01 | Best performance with the hip-spray head and with AC power supply (the one with the 8 AA battery pack does also work but is less convenient) |
| High Capacity Fan Spray w/Splash Shield, 12.7cm length | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-175-00 | There are several spray heads available, we tested this one successfully |
| Scalpel blades #22 and #10 | Swann-Morton, England | #10: 0201 #22: 0208 |
|
| Scalpel blade holder # 3 and #4 | Hausmann, Germany | #3: 06.103.00 #4: 06.104.00 |
|
| Lutz industrial blade | Lutz, Germany | 1022.0884 | |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Invitrogen, Switzerland | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco, Switzerland | 11960-044 | |
| Lactated Ringer’s solution (without glucose) | Bichsel, Switzerland | 133 0002 | |
| 6-well multi-well plate | TPP, Switzerland | 92006 | |
| Betadine solution | Mundipharma, Switzerland | 10055025 | |
| Surgical skin marker | Porex Surgical, Switzerland | 9560 | |
| Large cutting board | Any brand is possible | ||
References
- Lee, C. R., Iatridis, J. C., Poveda, L., Alini, M. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine (Phila Pa 1976). 31, 515-522 (1976).
- Chan, S. C. W., Gantenbein-Ritter, B., Leung, V. Y., Chan, D. Cryopreserved intervertebral disc with injected bone marrow-derived stromal cells: a feasibility study using organ culture. Spine. J. 10 (6), 486-496 (2010).
- Chan, S. C., Ferguson, S. J., Wuertz, K., Gantenbein-Ritter, B. Biological Response of the Intervertebral Disc to Repetitive Short Term Cyclic Torsion. Spine (Phila Pa 1976). , (2011).
- Gantenbein-Ritter, B., Sprecher, C. M., Chan, S., Illien-Jünger, S., Grad, S. Confocal imaging protocols for live/dead staining in three-dimensional carriers. Methods Mol. Biol. 740, 127-140 (2011).
- Gantenbein-Ritter, B., Potier, E., Zeiter, S., van der Werf, M. Accuracy of three techniques to determine cell viability in 3D tissues or scaffolds. Tissue Engineering Part C Methods. 14, 353-358 (2008).
- Rasband, W. S. . ImageJ. , (1997).
- Haschtmann, D., Stoyanov, J. V., Ettinger, L., Nolte, L. P., Ferguson, S. J. Establishment of a novel intervertebral disc/endplate culture model: analysis of an ex vivo in vitro whole-organ rabbit culture system. Spine. 31, 2918-2925 (2006).
- Gantenbein, B., Grünhagen, T., Lee, C. R., van Donkelaar, C. C. An in vitro organ culturing system for intervertebral disc explants with vertebral endplates: a feasibility study with ovine caudal discs. Spine. 31, 2665-2673 (2006).
- Korecki, C. L., Kuo, C. K., Tuan, R. S., Iatridis, J. C. Intervertebral disc cell response to dynamic compression is age and frequency dependent. J. Orthop. Res. 27, 800-806 (2009).
- Korecki, C. L., MacLean, J. J., Iatridis, J. C. Dynamic compression effects on intervertebral disc mechanics and biology. Spine (Phila Pa 1976). 33, 1403-1409 (1976).
- Jim, B., Steffen, T., Moir, J., Roughley, P., Haglund, L. Development of an intact intervertebral disc organ culture system in which degeneration can be induced as a prelude to studying repair potential. European Spine Journal. , 1-11 (2011).
