Préparation d'Intact disques intervertébraux Queue bovine pour la culture d'organe
Summary
Ce protocole illustre une technique de récolte pour les bovins coccygienne disques intervertébraux pour la culture d'organes pour<em> In vitro</emCulture d'organe>.
Abstract
Le disque intervertébral (DIV) est l'articulation de la colonne vertébrale reliant vertèbre en vertèbre. Il fonctionne pour transmettre le chargement de la colonne vertébrale et donner de la flexibilité de la colonne vertébrale. Il compose de trois compartiments: le noyau pulpeux intime (NP) englobant l'annulus fibrosus (AF), et deux plateaux cartilagineux reliant les NP et AF pour le corps vertébral, des deux côtés. Douleur d'origine discale éventuellement causé par une maladie dégénérative du disque intervertébral (DDD) et les hernies discales a été identifié comme un problème majeur dans notre société moderne. Pour étudier les mécanismes possibles de la dégénérescence IVD, dans les systèmes de culture in vitro d'organes avec cellules du disque live sont très attrayante. La culture in vitro de bovins intacts les DIV coccygienne a avancé à un système de modèle pertinent, qui permet l'étude de la mécano-biologique des aspects dans un environnement bien contrôlé physiologiques et mécaniques. DIV de la queue bovine peut être obtenue assez facilement en plus grand nombre uneD sont très similaires aux humains les DIV lombaires à l'égard de la densité cellulaire, la population de cellules et de dimensions. Toutefois, avant bovins caudale techniques de récolte DIV conservant plateaux cartilagineux et osseux plateaux échoué après 1-2 jours de culture depuis les voies de la nutrition étaient évidemment bloqué par du sang coagulé. DIV sont les plus grands organes avasculaire, par conséquent, les nutriments aux cellules de la NP dépendent uniquement sur la diffusion via les bourgeons capillaires du corps vertébraux adjacents. Présence de débris d'os et de sang coagulé sur les surfaces des plateaux vertébraux peuvent entraver la diffusion des nutriments dans le centre du disque et la viabilité cellulaire compromis. Notre groupe a établi un protocole relativement rapide à "craquer" les DIV-le de la queue avec un faible risque de contamination. Nous sommes capables de perméabiliser les surfaces fraîchement coupées des plateaux vertébraux osseux en utilisant un système de jet de lavage chirurgical, ce qui élimine les caillots de sang et de débris de coupe et de façon très efficace rouvre la voie de la diffusion de nutritionau centre de la DIV. La présence de plaques de croissance des deux côtés de l'os vertébral doit être évitée et d'être enlevés avant la culture. Dans cette vidéo, nous décrivons les étapes cruciales lors de la préparation et de démontrer la clé d'une culture d'organe réussie maintien de la viabilité cellulaire élevée pendant 14 jours dans la culture gonflement libre. Le temps de la culture pourrait être prolongé le cas échéant environnement mécanique peut être maintenue en utilisant bioréacteur chargement mécanique. La technique démontrée ici peuvent être étendues à d'autres espèces animales comme les porcins, ovins et lépreux isolement caudale ou lombaire DIV.
Protocol
Discussion
La première étape pour la culture d'organe réussie est de faire en sorte que l'explant ne doivent pas être contaminés. La queue doit être dépecé avant de commencer la procédure. Toute poils amené dans un laboratoire stérile pourrait être problématique en termes de contamination. La queue bovins devraient idéalement être aussi frais que possible (ce qui affecte la viabilité des cellules initiales). Par ailleurs, l'étape de lavage bétadine est recommandée pour réduire le risque de contamina…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a été soutenu par la Fondation nationale suisse (FNS # 310030-127586/1).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fresh bovine intervertebral disc tissue from bovine tails, from local slaughter house (ideally within hours post-mortem and without skin). | |||
| Pulsavac Plus AC System | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-486-01 | Best performance with the hip-spray head and with AC power supply (the one with the 8 AA battery pack does also work but is less convenient) |
| High Capacity Fan Spray w/Splash Shield, 12.7cm length | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-175-00 | There are several spray heads available, we tested this one successfully |
| Scalpel blades #22 and #10 | Swann-Morton, England | #10: 0201 #22: 0208 |
|
| Scalpel blade holder # 3 and #4 | Hausmann, Germany | #3: 06.103.00 #4: 06.104.00 |
|
| Lutz industrial blade | Lutz, Germany | 1022.0884 | |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Invitrogen, Switzerland | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco, Switzerland | 11960-044 | |
| Lactated Ringer’s solution (without glucose) | Bichsel, Switzerland | 133 0002 | |
| 6-well multi-well plate | TPP, Switzerland | 92006 | |
| Betadine solution | Mundipharma, Switzerland | 10055025 | |
| Surgical skin marker | Porex Surgical, Switzerland | 9560 | |
| Large cutting board | Any brand is possible | ||
References
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