Determinação da Raft Lipid Particionamento de Sondas marcadas com fluorescência em células vivas por Espectroscopia de Correlação de Fluorescência (FCS)
Summary
Uma técnica para sondar o particionamento jangada lipídico de proteínas fluorescentes na membrana plasmática de células vivas é descrito. Leva vantagem da disparidade em tempos de difusão de proteínas localizadas dentro ou fora de jangadas lipídicas. A aquisição pode ser realizada de forma dinâmica em condições de controlo ou após a adição da droga.
Abstract
Nos últimos quinze anos, a noção de que as membranas celulares não são homogêneas e dependem de microdomínios de exercer suas funções tornou-se amplamente aceita. Jangadas lipídicas são microdomínios de membrana enriquecidos em colesterol e esfingolipídios. Eles desempenham um papel em processos fisiológicos celulares, tais como sinalização, e 1,2 tráfico, mas também estão pensados para ser os principais intervenientes em várias doenças, incluindo infecções virais ou bacterianas e doenças neurodegenerativas 3.
No entanto, sua existência é ainda uma questão controversa 4,5. Na verdade, o tamanho rafts lipídicos foi estimado em cerca de 20 nm 6, muito abaixo do limite de resolução do microscópio convencional (cerca de 200 nm), impossibilitando a sua imagem direta. Até agora, as principais técnicas utilizadas para avaliar a partição de proteínas de interesse dentro de balsas lipídicas foram Membranas resistentes detergentes (DRMs) de isolamento, e co-patch com os anticorpos. Beca Embora amplamente utilizadauso de sua execução bastante fácil, estas técnicas eram propensos a artefatos e, portanto, criticou 7,8. Melhoramentos técnicos foram, portanto, necessário para ultrapassar estes artefactos e para ser capaz de detectar partição jangadas lipídica em células vivas.
Apresentamos aqui um método para a análise sensível de partição lípido jangadas de proteínas fluorescentes-etiquetados ou lípidos na membrana plasmática de células vivas. Este método, denominado Espectroscopia de Correlação de fluorescência (FCS), baseia-se na disparidade em tempos de difusão de sondas fluorescentes localizados dentro ou fora de jangadas lipídicas. De fato, como evidenciado em ambas as membranas artificiais e culturas de células, as sondas seria difundir muito mais rapidamente do lado de fora balsas lipídicas densos 9,10. Para determinar tempos de difusão, hora flutuações de fluorescência são medidos como uma função do tempo em um volume focal (aproximadamente 1 femtoliter), localizada na membrana plasmática de células com um microscópio confocal (Fig.1). As curvas de auto-correlação pode, então, ser extraída estas flutuações e equipado com modelos de difusão adequadas matemáticas 11.
FCS pode ser usado para determinar a jangada lípido particionamento de sondas diferentes, contanto que eles são fluorescentemente marcado. Fluorescente marcação pode ser conseguida através da expressão de proteínas de fusão fluorescentes ou por ligação de ligandos fluorescentes. Além disso, FCS pode ser usado não apenas em membranas artificiais e linhas de células, mas também em culturas primárias, como descrito recentemente 12. Também pode ser utilizado para seguir a dinâmica da compartimentação jangada lípido após a adição da droga ou a mudança de membrana composição lipídica 12.
Protocol
Discussion
O método aqui apresentado FCS permite uma análise sensível e rápido da compartimentação jangada lipídico de sondas fluorescentes de interesse em células vivas. FCS combina a precisão da localização de microscopia confocal com a sensibilidade de contagem de fotão único. A principal diferença entre FCS e técnicas padrão de bioquímicos é que permite a determinação de FCS absoluta da partição jangadas lipídica do alvo e não a partição relativa como é o caso para GDD isolamento ou de co-patching. <…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por uma subvenção da Agence Nationale de la Recherche (ChoAD). Também somos gratos ao ICM Fondation (Institut du Cerveau et de la Moelle) pelo apoio financeiro.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Cholera toxin subunit B-Alexa 488 | Invitrogen | C-34775 | MW (pentamer) = 57 kg/mol |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Incubator for temperature and CO2 control | Life imaging services | The Cube and the Box | |
| SPAD (Single Photon Avalanche Diode) | MPD (Micro Photon Devices) | PDM serie (100 μm sensitive area) | |
| High pass 488 nm filter | Semrock | 488 nm blocking edge BrightLine long-pass filter Part # FF01-488/LP-25 |
|
| FCS detection unit | Picoquant | Picoharp 300 module | |
| Acquisition and auto-correlation software | Picoquant | SymPhoTime | |
| Fitting software | OriginLab | OriginPro8 |
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