Summary
の皮内注射による皮膚リーシュマニア症の実験的ハムスターモデルの最適化
Abstract
伝統的に、ハムスターを実験的に鼻や足蹠に接種されています。しかし、これらのサイトで潰瘍は常に病変サイズの測定は難しい手順や動物は、発生しないので、病変の、食べる、呼吸と移動する難しさを示しています。皮膚リーシュマニア症は、若い成人男性と女性のゴールデンハムスター用ハムスターモデルを最適化するために( ゴールデンハムスター )1〜1.5×L0 7 リーシュマニア種の前鞭とその後の病変の進行と背部皮膚に皮内注射したが、最大の評価を行った16週間後に感染。それは彼らが異なる種による感染に感受性であるとしてバイオモデルは十分なリーシュマニアに対して薬物を評価するために考えられているので、ゴールデンハムスターが選択されています。慢性のが制御された病変のハムスター結果の皮膚感染症、ヒトで観察されたものと同様の症状の臨床進化。したがって、設立O硬結、潰瘍の面積に応じて病変の大きさを測定することにより、感染のfの範囲が可能である。このアプローチは、接種時にその汎用性と容易な管理を証明してフォローアップし、典型的な病変の評価(潰瘍)、さまざまな方法を通じて、治療のアプリケーションやさまざまな治療後の臨床サンプルから取得しています。このメソッドは運動に関する動物の生活の質、isalsoは、保存食や水、遊びや社会活動のための検索を使用します。
Protocol
1。ハムスターの感染
1。動物
140〜160グラムの重量を量る近交系雌と雄のゴールデンハムスター( ゴールデンハムスター )、6-8週間は、使用されています。彼らは標準的なげっ歯類の乾燥食品を供給し、水を自由に摂取が設けられ、温度制御された宿泊施設では、動物施設に収容されています。動物を含むすべての手順は、実験動物の使用のための制度倫理委員会によって承認されています。皮膚に集まるリーシュマニア寄生虫の動物を用いた感染実験の前に標準化された手順に従って、性別のマークが付けられ、重み付けされます。性判別のために、動物はそのような乳腺線の可視化と女性の短いあの生殖器の距離、または睾丸の可視化と男性の肛門と包皮の間に大きな距離と独特の機能のために検査されます。その後、動物は耳ピアスしたり、浸した綿棒で皮膚の領域を染色してマークされているピクリン酸である。耳の穿孔のために、70%アルコールで拭いた後、耳にはげっ歯類用の耳パンチを使用してピアスしています。血管の領域は、避けなければならない。 260-300μL25-Gの針をお勧めします。量のケタミン(50 mg / kg)及びXilacine(20 mg / kg)を腹腔内投与の混合物9時01分と鎮静または麻酔最後に、動物は、高精度のバランスに調整されるトラップまたはボックスにそれらを置くことによって計量されています。
2。寄生虫
このようなLと皮膚に集まるリーシュマニア種の前鞭、 amazonensisは 、26で相性ノービ-MacNeal·ニコル(NNN)培地で培養℃でハムスターに感染するareused Metacyclic(固定)の位相前鞭(5日)。簡単に言えば、寄生虫が収穫され、1×10 7(男性用)または1.5×10 7(女性)は、それぞれ、男性または女性に接種、0.1 mlのPBSで寄生虫にカウントし、調整し、二リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄ししかし、接種サイズはリーシュマニア種(手順ビデオには示されていない)によると異なる場合があります。
3。実験感染
皮膚領域は、接種前に剃毛されています。簡単に言うと、麻酔動物は腹臥位に置き、はさみを使用していて、髪は尾の基部から2インチを削除されます。丘疹が形成されるまで滅菌生理食塩水で剃毛面積をクリーンアップした後に寄生虫接種は皮内注射されています。
4。臨床フォローアップ
動物は4つまで7日ごとに監視されます - 6週間病変の出現のために接種した後。まもなく、動物を罠で固定化され、接種した皮膚の面積が触診されています。その後、形成された潰瘍の硬化領域が区切られており、幅と潰瘍の長さはデジタルノギスで測定されます。
2。ハムスターの治療
1。管理化合物のistration
動物は潰瘍性病変(4-6週間後に接種)を開発したときに治療スケジュールが始まります。動物は、試験される各化合物について5月6日の動物のグループで配布されています。化合物は、局所、経口、筋肉内または病巣内経路によって投与することができる。薬物の適用前に、ハムスターを麻酔しており、病変領域は、生理食塩水またはPBSを用いて洗浄される。化合物は、局所または病変を介して印加されると、ハムスターは、化合物は経口又は筋肉内経路により投与されたときにハムスターがしっかりと首の付け根で固定されている間に治療するための領域を露出させてトラップに固定化されています。 1)局所適用:化合物は病変にisappliedと数分後に動物がcage.bに返されます)筋肉内注射の場合、薬は後半部の半腱様のまたは半膜様筋を通して(200μlの最大値)を注入されています。 c)の経口adminisについてtrationは、薬を1mlのシリンジに接続されてオーロ胃プローブ14Gを介して動物(200μlの最大)に提供されます。 d)の病変内注射のために薬(100μlの最大)は徐々に下に置かれベベルと26Gゲージ針を用いて潰瘍のベースに注入されています。病変の全体面積は、針の回転によって覆われています。治療は、定義されている治療のスキームに従って、10-20日の間毎日投与されています。
2。臨床フォローアップ
この実験モデルで新しいantileishmanial化合物の効果は治療後の病変の治癒と瘢痕に応じて決定されているので、各動物の臨床モニタリングが後の化合物と3ヶ月までのアプリケーションの終了時に毎週行われます。監視中に、病変の種類が記載されており、硬結、潰瘍面積はデジタルノギスで測定されます。にさまざまな地域で病変の存在接種部位だけでなく、病変の再発の外観についても説明し、登録されています。隔週で、動物が加重され、病変が描かれています。動物は、監視するために毎日観察されています)外見(髪、調整、温度、目、耳の位置、グルーミング、排便、腹水の存在、攪拌、脱水)とb)の動作は、(思いやり、好奇心、警告、目を覚まし、)、グループでご利用いただけキャッチする食べ物や飲み物、ハードを楽しみにしています。化合物の適用部位は、充血、炎症、かむと脱毛の有無を観察しています。
ハムスターは、(下記参照)の化合物の毒性と関連付けすることができる。血液および血清学的な値を決定するために、治療終了後45日目に採血されています。
各治療の有効性は、以下のスコアSYSTを使用して、前と治療後の病変のサイズを比較して評価されているEM:(100%領域と病変の完全消失の治癒) 硬化 、 臨床症状の改善 (面積> 50%で病変のサイズを小さくする)、 臨床障害 (病変のサイズを大きくする) 再発病変に硬化後)。研究の終わりに、動物がCO2前の麻酔の吸入により屠殺されています。死の後で、寄生虫学的および血清学的分析に必要な試料を採取しています。
3。寄生虫学的試験
皮膚からのサンプルにおけるリーシュマニアの存在(病変または瘢痕)が、肝臓、脾臓、腎臓は、ギムザ1とこれらの組織の病理組織学的検査(下記参照)で染色した塗抹標本を調べることによって直接決定されます。
病変部位における寄生虫の負担は、タイタスら(1985)2に従って限界希釈法によって推定されています。簡単に言えば、組織の小片が削除されます各動物から、秤量し、シリンジのプランジャーを使用して、冷PBS溶液中でホモジナイズした。得られた懸濁液を4℃で10分間、600グラムで遠心分離されていその後、上清は廃棄され、ペレットを1%の抗生物質および10%ウシ胎児血清を含むRPMI 1640培地に再懸濁されています。サスペンションの百リットルを50μlシュナイダーの培地でNNN培地オーバーレイを含むマイクロタイタープレートに96ウエルの各々に移して26℃に保持されている各サンプルの実行可能な寄生虫の数は前鞭が1ヶ月間毎週倒立顕微鏡下で検査によって検出される可能性があるときの最高希釈から決定されます。
4。皮膚病変(または瘢痕)や他の組織の病理組織学的検査
皮膚、肝臓、腎臓から採取した生検標本の第三の作品は、10%ホルマリンで固定し、パラフィンに埋め込まれています。脾臓、心臓からの標本も処理することができます。 F固定組織のIVEミクロンの切片をhaemotoxilin-エオシンで染色し、マイクロアーキテクチャ、細胞浸潤の特性、および寄生虫の有無を調べるため200X、400Xまたは1000X油浸を用いた光学顕微鏡下で観察した。顕微鏡写真を撮影したデジタル画像は、キャプチャされます。
5。治療毒性の評価
化合物の毒性活性は、(上記参照)フォローアップの臨床時に監視対象のパラメータに応じて動物の物理的および動作条件に基づいています。上記のような毒性はまた、血液サンプルとhaemotoxilin - エオシンで染色した組織切片で観察された病理組織学的変化で血液と代謝パラメータに従って決定されます。
血液サンプルは、好ましくは、心臓、心室から取得されます。血液学的検査に、血液はEDTA抗凝固チューブに移し、に従って処理されます完全な血球数のプロトコルを標準化する。血清学的検査に、血は1.5エッペンドルフバイアルに移し、コダックEktachemdry化学3を使用して測定したクレアチニン、ALTとBUNレベルの代謝解析のために血清を得るために遠心分離されています。
6。データ解析
処理および未処理の動物からのデータがANOVAの検定を用いて比較されます。有意性はp <0.05に設定されています。
4。代表的な結果
要約
皮膚リーシュマニア症のハムスターモデルは、薬効スクリーニングにこのモデルを使用する目的で改善されました。病変の開発および寄生虫学的パラメータは、ハムスターの皮膚皮膚の主な感染症に検討した。近交系雌性および雄性ゴールデンハムスター( ゴールデンハムスター )、6-8週間は、1×10 7(男性用)または1.5×10 7(女性用)metacyclで皮内注射したLのIC(固定相)前鞭amazonensis。結節は20に登場 - 35日π、感染が確立された後、2つの用量で五価アンチモン(SBV)の有効性がevalautedされたπ4-6週間後、形成潰瘍。ハムスター5匹ずつの3グループに無作為に割り付けられたと筋肉内経路により10日間の間に80または120 mgをSBV / kgの毎日で、メグルミンのアンチモンで処理した。第三のグループは、プラセボとしてPBSで筋肉処理した。 3匹の動物のグループは、未処理およびネガティブコントロールとして使用した。それぞれの治療に対する反応は3ヶ月の治療期間の終了後に続いた。
1。 L.後の臨床経過ゴールデンハムスター( ゴールデンハムスター )のamazonensis感染
背部皮膚に感染したハムスターは、一貫して感染後4-6週間で表皮の臨床的に明らかな潰瘍を開発しています。病変は小結節と終了潰瘍で始まる時間後の感染症に応じてサイズが大きくなると(4週に18,99に54.7 mm 2と、感染後6週目に第四による実験的な薬の効果を評価するための最適なサイズを考慮したものに達する6週間に35,55に92,71 mm 2)を(Figures1、2)。病変はその後の実験が終了したその時点で最大20週間後に感染するためには明らかな潰瘍、(図1)を維持しています。
L.による感染amazonensisた (p> 0.05、ANOVA)は、それぞれ感染していないと感染したハムスターで104,9 124,69からGRと129,71の134,02グラムに変化させたハムスターの体重には影響しません。動物は、試験中に25,58の平均値±体重の5,98%を得た。クレアチニンとアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)と血液像パラメータのseric値が感染していないとリーシュマニアに感染したハムスターの参照値に類似していた。 BUN尿素窒素(BUN)レベルのみであった感染した動物の60%でugmented。
L.に感染したハムスターの病変の病理組織学的解析amazonensisは、これらの感染動物に関連した違いを示した。それらはL.に感染したのに対し、一般的には、感染していないハムスターの皮膚生検は、全く炎症反応または任意の組織学的変化(図3a)を表示しないamazonensisは、肉芽腫性皮膚炎と真皮に浸潤マクロファージの豊富な存在(図3b)を開発しています。 L.に感染したハムスターからの組織の病理組織学的解析amazonensisと10日の間に80および120 mgをSBV / kg /日の用量でメグルミンのアンチモンで処理は、対照群(感染および未処理)で観察されたものと同様の感染プロセスに関連した変化を示した。一般的には、ハムスターの皮膚サンプルは、リンパ球の中等度の浸潤(80%)を伴うplasmocytes(20%)、PMN(80%)細胞のわずかなレベルを示し、(20%)、軽度または重度(80%)infiltrマクロファージの評価作業を容易に(表2)。これらの観察は、真皮と下にある筋肉を損なう炎症イベント、肉芽腫性皮膚炎の診断に対応しています。これは、研究ではすべての動物の皮膚リーシュマニア症の重篤な症状と互換性のある感染症に関連した主な病変である。 P <0.05が得られたピアソンのカイ二乗する場合は、この関連付けは統計的に相関していた。動物の百分の60から100の腎臓サンプルでは、動物の75%の腎臓のわずかな萎縮を伴う腎皮質とglomerulesで中等度の過形成を示した。これらの観察は、細胞膜増殖glomerulonefritis、以前に他のリーシュマニア種による感染による感染に関連している診断と互換性があります。統計的関連はピアソンp <0.05のカイ二乗と大きかった。すべてのグループの動物の40から100パーセントの肝臓はassociatかもしれない肝細胞のわずかな液胞の変化を示したそのようなグリコーゲンの蓄積肝細胞などの生理的プロセスへのED。そのような脂肪変性、線維化、輻輳などの他の肝組織の異常は、感染プロセスに対応しています。このような液胞肝細胞の変化、cardiomegalies、細胞質内好酸球の介在物の存在と同様に、腎管の細胞の空胞化などの他の観測は、統計的に試験化合物の毒性効果に(P> 0.05)に関連すると可能性がありますされていませんハムスターの生理学的プロセスに起因する。
2。ハムスターモデルにおけるメグルミンアンチモンの治療効果
治療後の異なる時点で感染したハムスターの臨床表現型を表1に要約されています。 10日中に120mgのSBV / kg /日の用量で筋肉内メグルミンのアンチモンを用いた治療の重量はLの誘導を完全に回帰非常に有効であったすべての動物でamazonensis病変(図4。)治癒の割合は2〜8週間の治療後の期間内に100%であった。しかし、3ヵ月後の病変の再発は、ハムスターの20%に観察された。メグルミンアンチモンが80ミリグラムSBV / kg体重で投与した場合、完全な治癒は、3匹の動物で観察された。他の二つの動物では病変が(図5)は、それぞれ33,9と69,0%減少した。 3ヶ月後、L. amazonensisは80mg SBV / kg / dayとメグルミンアンチモン120mgのSBV / kg /日で処理した動物の唯一の用量でメグルミンアンチモンで処理されたすべての動物の皮膚に存在するままであった。 10日間筋肉内120 mgをSBV / kg /日の治療用量を決定した。
限界希釈アッセイを用いて、寄生虫の推定数は、負(未処理)制御と車両と比較して、メグルミンのアンチモン(プラセボ)投与群(P <0.001)と治療群のための重要な減少を示した。実行可能な寄生虫(0.4から1、皮膚組織のmgあたり6寄生虫)が未処理の動物とPBSで治療を受けたの病変部位で検出された。 120 mg / kg /日(図5b)および80 mg / kg /日(図5c)で処理した2ハムスターで処理された一匹:寄生虫は、アンチモン酸メグルミンを用いた治療に反応しなかったこれらの動物から単離された。有意差は、未処理またはPBSで処理した動物に比較してメグルミン輝安鉱を受信した後、硬化しなかったハムスターの寄生負荷で観察されなかった。
120mgのSBV / kg /日で筋肉メグルミンアンチモンで処理されたハムスターの皮膚生検の病理組織学的に全く寄生虫が観察されていません。真皮に浸潤するマクロファージおよび少数のリンパ球(図6a、6b)を見られている。反対に、ハムスターが広範囲に80mgのSBV / kg /日、真皮に浸潤マクロファージの豊富な存在と肉芽腫性皮膚炎でメグルミンアンチモンで処理した場合(図6c、6dの)が観察されています。
有効性研究のために同じ治療方式を使用して、80と120メグルミンアンチモンの毒性は投与SBV / kg体重を評価した。一般的な健康状態および体重は、最後の投与後3ヶ月までモニターした。による治療は、それぞれ感染していないと感染したハムスターで104,9 124,69からGRと129,71の134,02グラムに変化させたハムスターの体重に影響を及ぼさなかった。動物は27,59の平均値±治療と28,74時の体重の4,22%±2,26%、フォローアップ時に(P <0.05、ANOVA)を得た。重量の損失は処理(データは示されていない)のいずれかの群で観察されなかった。クレアチニンとアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)と血液像パラメータのseric値が未処理とメグルミンアンチモン治療ハムスターの参照値に類似していた。 BUN尿素窒素(BUN)のレベルのみが処理された動物の20%に増強された。
HistopatL.に感染したハムスターからの組織のhological分析amazonensisと10日の間に80および120 mgをSBV / kg /日の用量でメグルミンのアンチモンで治療は、薬物の毒性に関連する変化は認められなかった。
治療後のリン酸緩衝生理食塩水A、B、日。
表1。L.の臨床的表現型メグルミンアンチモンで処理した後amazonensis実験的に感染させたハムスター
各治療の有効性は、以下のスコアシステムを使用して、前と治療後の病変サイズを比較評価した。 治療 (100%領域と病変の完全消失の治癒) 臨床症状の改善が (> 50%で病変のサイズを小さくする地域の) 臨床障害 (病変のサイズを大きくする)再発(硬化後の病変の再活性化)。
:省略記号、NA:適用されません。M:軽度; M:中程度の、S:重度; PMN:多形核好中球、NSL:いいえ重要な病変、GDM:肉芽腫皮膚筋炎; PGD:Pyogranulomatous皮膚炎。 1。リンパ管拡張症2。鉱物のような素材。
表2。ハムスターの皮膚の病理組織学的には実験的に感染したL. amazonensisとメグルミンアンチモンで処理
1から1.5×10 7 Lで皮内接種したハムスターに感染後の皮膚病変の開発図1。コースamazonensis metacyclic(固定相)は20週間の間に前鞭。 y軸はmmで潰瘍面積を表しています。
図2。Photog2週間()、4週間(b)および6週間(c)の少なくとも10×10 7の皮内接種後のゴールデンハムスターの背部皮膚に病変が潰瘍の開発の歴史raphyic。
図3スキン(1)ハムスター感染と未処理の生検:なし、炎症反応も重要な組織学的変化が観察されること、(b)ハムスターが感染と治療:多核巨細胞の存在(矢印プラスアスタリスク)と肉芽腫性皮膚炎と豊富な寄生虫(黒矢印)やマクロファージ(白矢印)が真皮に浸潤する。ヘマトキシリン - エオシン染色400X。
図4。L.に感染したハムスターの臨床反応の写真史amazonensisと120mgのSBV / kg /日ドゥリンで筋肉メグルミンアンチモンで処理 gで10日。写真は治療の終わり(10日)(b)で、治療前に病変の外観を()表示し、フォローアップ時:30日(C)、60(d)と90(e)の後治療。
図5:ハムスターの皮膚リーシュマニア症の治療におけるメグルミンアンチモンの効果。ゴールデンハムスターは、L.に感染していた背部皮膚にamazonensis。感染症の6週間後、彼らは、未処理の()またはPBS単独(b)は、メグルミンアンチモン120mgをSBV / kg /日(c)又は80mgのSBV / kg /日(d)で10日間筋肉内治療を行った。グラフは、治療終了後の治療の終了時に病変サイズ(0日)の減少の割合を示し、日目の15、30、60および90のフォローアップ。 P 120または80 <0.001ミリグラムSBV / kg /日対車両ではなく、治療。
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図6皮膚は120mgのSBV / kg /日(A、B)および80mg SBV / kg /日(C、D)に感染し、筋肉内megumineのantinmoniateで処理されたハムスターからの生検。希少マクロファージおよび真皮に浸潤リンパ球の存在。いいえ寄生虫が観察されていません。貪食寄生虫と泡沫状マクロファージ;ヘマトキシリン - エオシンでは、広範囲に真皮に浸潤するマクロファージの豊富な存在(c)と1000X(c)の肉芽腫性皮膚炎、200X(a)を染色。ヘマトキシリン - エオシン(d)は1000倍、200倍(b)に染色。
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Discussion
皮膚リーシュマニア症は熱帯と新熱帯区で風土病となっている。それは、しばしば小さな皮膚結節から総粘膜組織の破壊に及ぶ臨床症状の多様なスペクトラムの疾患群と呼ばれています。最も利用可能な薬は高価であり、長い治療レジメンを必要とし、新薬の発見を必要と、ますます効果的になりつつあります。
マウスモデルは、広く使われているが、いくつかの欠点を持っています。非常にBALB / cに見られるように拡大する潰瘍性病変によって特徴づけ持続感染による影響を受けやすいと。したがって、例えば、皮膚に集まるリーシュマニア種の前鞭の皮内注射した後に開発した病変に基づいて、マウスは3つのグループに分けることができたDBA / 2、DBA / 3匹、CBA / H、のC3H/Heおよび/ Jと高度耐性群では、実際の病変代表的な性能特性に見られるように病変が8週間以内に解決する可能性があり比較的耐性群皮膚リーシュマニア症のCALはNZBおよびC57BL / 6マウス4に見られるように注射で開発しています。彼らが影響を受けやすいように病気の進行が著しく、様々な一般的な近交系マウスとリーシュマニア種の間で変化する皮膚リーシュマニア症のマウスモデルとは対照的に、ゴールデンハムスターは、 ゴールデンハムスターは、バイオモデルの適切なは、 リーシュマニア種に対して薬物を評価するために考えられているリーシュマニア 。5,6,7,8,9,10,11,12,13,14の種による感染に。皮膚に集まるリーシュマニア種のいずれか(固定相)metacyclic前鞭の接種は1〜2ヵ月後の接種の間に皮膚病変を引き起こすことができます。病変は潰瘍に、後結節に進化して丘疹としてpiと明らかに20日になります。接種部位(PE鼻、foodpad、耳またはベース尾)から応じてハムスターは、実験感染後番目の大部分を予測可能な病気の進行を表示します。eの時間は、皮膚リーシュマニア症の人間で観察されたものと同様の慢性潰瘍性局所病変の開発を特徴とする。しかし、人間のように、病変は各個人の免疫状態の応じてサイズが変化するため、いくつかのハムスターにしようとすると、病変を解決するために、その結果、病変の大きさの減少が見られます。
この資料では、Lの前鞭を使ってハムスターの背部皮膚に感染実験を説明していますがamazonesisは 、このモデルでは、接種のサイズだけを変更して、他の皮膚に集まるリーシュマニア種に対しても可能である。要約すると、背部皮膚で前鞭の皮内注射のアプローチは、ハムスターの背部皮膚に誘導される皮膚リーシュマニア症の診療所と病理学的特徴は、人間の病気に非常に類似していることを示しています。さらに、特定の化合物またはdで処理した後の潰瘍のフォローアップの臨床ラグは、背部皮膚における誘導CLのこのモデルでは促進される。病変の進化は、容易に治療前と後に得られた病変の大きさを比較することによって決定されます。治癒の点で臨床反応は容易に再上皮化(図4に示すように)に従って続いています。我々は、 リーシュマニア種とハムスターの背部皮膚の感染実験では化合物の可能性を秘めていることを検証するための有用なモデルを表していると結論antileishmanial薬の候補となります。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
COLCIENCIASと熱帯病に対する製品の開発のためのセンター - - CIDEPRO本研究では、アンティオキア大学(CODI)、科学技術の発展のためにコロンビア大学での研究のための委員会からの補助金によって支えられている。
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Ketamine | Reagent | Holliday –Scott S.A | ||
Xilacine | Reagent | Synthesis | ||
PBS | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-136 | |
Digital caliper | Equipment | Fisher Scientific | 15-077-958 | |
Giemsa | Reagent | Sigma-Aldrich | GS1L-1L | |
Formalin | Reagent | Nova lab | 11273 | |
Paraffin | Reagent | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | |
Haemotoxilin | Reagent | Nova lab | 10870103 | |
Eosin | Nova lab | 10870203 | ||
Kodak Ektachem dry chemistry | Equipment | Kodak Ektachem | DT-60 | |
meglumine antimoniate | Reagent | Aventis | ||
Microscopy | Equipment | Nikon Instruments | YS2-T |
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