מערכת ניסיונית ללמוד Mechanotransduction ב לתאי ריאה עוברית
Summary
כוחות מכניים לשחק תפקיד מפתח בהתפתחות הריאות ופגיעה ריאות. כאן אנו מתארים שיטה לבודד העובר מכרסמים ריאה מסוג תאים השנייה אפיתל fibroblasts ולחשוף אותם באמצעות גירוי מכני<em> במבחנה</em> המערכת.
Abstract
כוחות מכניים שנוצר בתוך הרחם על ידי נשימה דמויי תנועות החוזרות על עצמן ועל ידי distension נוזלים חיוניים להתפתחות הריאות נורמלי. מרכיב מרכזי של התפתחות הריאות הוא הבידול של מכתשיים תאים מסוג II של אפיתל, המקור העיקרי של פעילי שטח ריאתי. תאים אלה גם להשתתף הומאוסטזיס נוזל לומן מכתשיים, ההגנה המארחת, ותיקון פציעה. בנוסף, דיסטלי ריאות תאים parenchyma יכולים להיחשף ישירות מתיחה מוגזמת במהלך הנשמה מלאכותית לאחר הלידה. עם זאת, המנגנונים של המולקולה והתא מדויק שבו לתאי ריאה לחוש גירויים מכניים להשפיע על התפתחות הריאות ולקדם פציעה ריאות אינם מובנים לחלוטין. כאן, אנו מספקים שיטה פשוטה טוהר גבוהה על מנת לבודד סוג התאים השנייה ו fibroblasts מהריאות מכרסמים העובר. לאחר מכן, אנו מתארים במבחנה המערכת, יחידת הזנים Flexcell, כדי לספק גירוי מכאני לתאים עובריים, המדמה כוחות מכניים בריאות התפתחות העובר או פציעה ריאות. מערכת הניסוי מספק כלי מצוין כדי לחקור מנגנונים מולקולריים הסלולר לתאי ריאה בעובר שנחשפו להתמתח. באמצעות גישה זו, המעבדה שלנו זיהתה כמה קולטנים וחלבונים איתות המשתתפות mechanotransduction בפיתוח ריאות העובר פציעה ריאות.
Protocol
Discussion
בכתב יד זה, אנו מתארים שיטה לבודד תאים עובריים סוג II של אפיתל fibroblasts ולחשוף אותם גירוי מכני באמצעות מנגנון הזנים Flexcell. השתמשנו בטכניקה זו כדי להעריך את התמיינות של תאים אפיתל 1,2 ו ללמוד הקולטן מסלולי איתות מופעל על ידי מתיחה 3-9. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש גם כ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
נתמך על ידי NIH מענק HD052670.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5648 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130 | |
| Collagenase 1A | Sigma | C9891 | |
| Chicken serum | Sigma | C5405 | |
| Screen cups | Sigma | CD1-1KT | |
| Syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-25 | |
| 100 micron nylon mesh | Small Parts, INC | CMN-100-D | |
| 30 micron mesh | Small Parts, INC | CMN-30-D | |
| 15 micron mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX15 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen-1 | Collagen Biomed | PC0701 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Vitronectin | Sigma | V-0132 | |
| Elastin | Sigma | E-6402 | |
| Bioflex plate | Flexcell International | BF-3001U | Uncoated |
| Flexcell Strain Unit | Flexcell International | FX-5000 |
References
- Sanchez-Esteban, J., Tsai, S. W., Sang, J., Qin, J., Torday, J. S., Rubin, L. P. Effects of mechanical forces on lung-specific gene expression. Am. J. Med. Sci. 316, 200-204 (1998).
- Sanchez-Esteban, J., Cicchiello, L. A., Wang, Y., Tsai, S. W., Williams, L. K., Torday, J. S., Rubin, L. P. Mechanical stretch promotes alveolar epithelial type II cell differentiation. J. Appl. Physiol. 91, 589-595 (2001).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Gruppuso, P. A., Rubin, L. P. Mechanical stretch induces fetal type II cell differentiation via an epidermal growth factor receptor-extracellular-regulated protein kinase signaling pathway. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 30, 76-83 (2004).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Lee, N., Silbert, O., McKnight, N. L., Frangos, J. A. Strain-induced fetal type II epithelial cell differentiation is mediated via cAMP-PKA-dependent signaling pathway. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 291, L820-L827 (2006).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Filardo, E. J., Rubin, L. P., Ingber, D. E. Integrins {beta}1, {alpha}6, and {alpha}3 contribute to mechanical strain-induced differentiation of fetal lung type II epithelial cells via distinct mechanisms. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 290, L343-L350 (2006).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Soto-Reyes, D., Lee, H. S., Warburton, D., Sanchez-Esteban, J. Mechanical stretch promotes fetal type II epithelial cell differentiation via shedding of HB-EGF and TGF-alpha. J. Physiol. 587, 1739-1753 (2009).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Drouillard, D., Santos, M., Hokenson, M. A., Hawwa, R. L. A role for caveolin-1 in mechanotransduction of fetal type II epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 298, L775-L783 (2010).
- Lee, H. S., Wang, Y., Maciejewski, B. S., Esho, K., Fulton, C., Sharma, S. Interleukin-10 protects cultured fetal rat type II epithelial cells from injury induced by mechanical stretch. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 294, L225-L232 (2008).
- Hawwa, R. L., Hokenson, M. A., Wang, Y., Huang, Z., Sharma, S., Sanchez-Esteban, J. IL-10 inhibits inflammatory cytokines released by fetal mouse lung fibroblasts exposed to mechanical stretch. Pediatric Pulmonology. , (2011).
- Kitterman, J. A. The effects of mechanical forces on fetal lung growth. Clin. Perinatol. 23, 727-740 (1996).
- Harding, R., Crystal, R. G., West, J. B., Banes, P. J. Fetal breathing movements. The Lung: Scientific Fountations. , 2093-2104 (1997).
- Harding, R., Liggins, G. C. Changes in thoracic dimensions induced by breathing movements in fetal sheep. Reprod. Fertil. Dev. 8, 117-124 (1996).
