والنظام التجريبي لدراسة Mechanotransduction في خلايا رئة الجنين
Summary
القوات الميكانيكية تلعب دورا أساسيا في نمو الرئة وإصابة الرئة. هنا، نحن تصف وسيلة لعزل القوارض نوع رئة الجنين الخلايا الظهارية الثاني والخلايا الليفية، ويعرضهم لتحفيز الميكانيكية باستخدام<em> في المختبر</em> نظام.
Abstract
القوات الميكانيكية ولدت في الرحم بواسطة حركات التنفس تشبه المتكررة وانتفاخ سائل بالغة الأهمية بالنسبة لتنمية رئة طبيعية. ومن المكونات الرئيسية للتنمية الرئة هو نوع من التمايز خلايا سنخية الثاني الظهارية، المصدر الرئيسي للتوتر السطحي الرئوي. هذه الخلايا أيضا المشاركة في توازن السوائل في التجويف السنخي، دفاع المضيف، وإصلاح الضرر. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن خلايا الرئة البعيدة حمة يتعرض مباشرة لتمتد مبالغ فيه خلال التهوية الميكانيكية بعد الولادة. ومع ذلك، لا أن الآليات الدقيقة الجزيئية والخلوية من قبل خلايا الرئة التي تستشعر المحفزات الميكانيكية للتأثير على نمو الرئة وتعزيز إصابة الرئة مفهومة تماما. هنا، ونحن نقدم طريقة بسيطة ونقاء عالية لعزل نوع الخلايا الليفية والثاني من الرئتين القوارض الجنين. ثم، ونحن تصف في نظام المختبر، وحدة الانفعال فليكسسيل، لتوفير التحفيز الميكانيكي للخلايا الجنين، ومحاكاة القوات الميكانيكية فيتكون الجنين الرئة أو إصابة الرئة. هذا النظام التجريبي يوفر أداة ممتازة لتحقيق الآليات الجزيئية والخلوية في خلايا الرئة الجنين عرضة للتمدد. باستخدام هذا النهج، وقد حددت مختبرنا مستقبلات عدة والبروتينات مما يشير إلى أن المشاركة في mechanotransduction في تطوير رئة الجنين وإصابة الرئة.
Protocol
Discussion
في هذا المخطوط، وصفنا وسيلة لعزل الخلايا الجنينية النوع الثاني الطلائية والخلايا الليفية، ويعرضهم لتحفيز الميكانيكية باستخدام جهاز الانفعال فليكسسيل. وقد استخدمنا هذه التقنية لتقييم تمايز الخلايا الظهارية 1،2 و لدراسة مستقبل ومسارات إشارات تفعيلها من خلال ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح HD052670.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5648 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130 | |
| Collagenase 1A | Sigma | C9891 | |
| Chicken serum | Sigma | C5405 | |
| Screen cups | Sigma | CD1-1KT | |
| Syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-25 | |
| 100 micron nylon mesh | Small Parts, INC | CMN-100-D | |
| 30 micron mesh | Small Parts, INC | CMN-30-D | |
| 15 micron mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX15 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen-1 | Collagen Biomed | PC0701 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Vitronectin | Sigma | V-0132 | |
| Elastin | Sigma | E-6402 | |
| Bioflex plate | Flexcell International | BF-3001U | Uncoated |
| Flexcell Strain Unit | Flexcell International | FX-5000 |
References
- Sanchez-Esteban, J., Tsai, S. W., Sang, J., Qin, J., Torday, J. S., Rubin, L. P. Effects of mechanical forces on lung-specific gene expression. Am. J. Med. Sci. 316, 200-204 (1998).
- Sanchez-Esteban, J., Cicchiello, L. A., Wang, Y., Tsai, S. W., Williams, L. K., Torday, J. S., Rubin, L. P. Mechanical stretch promotes alveolar epithelial type II cell differentiation. J. Appl. Physiol. 91, 589-595 (2001).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Gruppuso, P. A., Rubin, L. P. Mechanical stretch induces fetal type II cell differentiation via an epidermal growth factor receptor-extracellular-regulated protein kinase signaling pathway. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 30, 76-83 (2004).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Lee, N., Silbert, O., McKnight, N. L., Frangos, J. A. Strain-induced fetal type II epithelial cell differentiation is mediated via cAMP-PKA-dependent signaling pathway. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 291, L820-L827 (2006).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Filardo, E. J., Rubin, L. P., Ingber, D. E. Integrins {beta}1, {alpha}6, and {alpha}3 contribute to mechanical strain-induced differentiation of fetal lung type II epithelial cells via distinct mechanisms. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 290, L343-L350 (2006).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Soto-Reyes, D., Lee, H. S., Warburton, D., Sanchez-Esteban, J. Mechanical stretch promotes fetal type II epithelial cell differentiation via shedding of HB-EGF and TGF-alpha. J. Physiol. 587, 1739-1753 (2009).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Drouillard, D., Santos, M., Hokenson, M. A., Hawwa, R. L. A role for caveolin-1 in mechanotransduction of fetal type II epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 298, L775-L783 (2010).
- Lee, H. S., Wang, Y., Maciejewski, B. S., Esho, K., Fulton, C., Sharma, S. Interleukin-10 protects cultured fetal rat type II epithelial cells from injury induced by mechanical stretch. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 294, L225-L232 (2008).
- Hawwa, R. L., Hokenson, M. A., Wang, Y., Huang, Z., Sharma, S., Sanchez-Esteban, J. IL-10 inhibits inflammatory cytokines released by fetal mouse lung fibroblasts exposed to mechanical stretch. Pediatric Pulmonology. , (2011).
- Kitterman, J. A. The effects of mechanical forces on fetal lung growth. Clin. Perinatol. 23, 727-740 (1996).
- Harding, R., Crystal, R. G., West, J. B., Banes, P. J. Fetal breathing movements. The Lung: Scientific Fountations. , 2093-2104 (1997).
- Harding, R., Liggins, G. C. Changes in thoracic dimensions induced by breathing movements in fetal sheep. Reprod. Fertil. Dev. 8, 117-124 (1996).
