Een experimenteel systeem om Mechanotransductie in foetale long cellen te bestuderen
Summary
Mechanische krachten spelen een belangrijke rol in de longen de ontwikkeling en longschade. Hier wordt beschrijven een werkwijze voor knaagdier foetale long type II epitheelcellen en fibroblasten te isoleren en blootstellen aan mechanische stimulatie met een<em> In vitro</em> Systeem.
Abstract
Mechanische krachten die ontstaan in de baarmoeder door repetitieve ademhaling-achtige bewegingen en door vocht opgezette buik zijn van cruciaal belang voor een normale long ontwikkeling. Een belangrijk onderdeel van de long ontwikkeling is de differentiatie van de alveolaire type II epitheelcellen, de belangrijkste bron van pulmonale surfactant. Deze cellen nemen ook deel aan vocht homeostase in het alveolaire lumen, afweer, en letsel reparatie. Bovendien kan distale longparenchym cellen direct worden blootgesteld aan overdreven rek bij mechanische ventilatie na de geboorte. Echter, de precieze moleculaire en cellulaire mechanismen die longcellen voelen mechanische stimuli om long-ontwikkeling te beïnvloeden en longschade te bevorderen niet helemaal duidelijk. Hier bieden wij een eenvoudige en hoge zuiverheid methode om type II cellen en fibroblasten van knaagdieren foetale longen te isoleren. Vervolgens beschrijven we een in vitro systeem De Flexcell Strain eenheid mechanische stimulatie voor foetale cellen simuleren mechanische krachten infoetale long ontwikkeling of longschade. Deze experimentele systeem biedt een uitstekend hulpmiddel om de moleculaire en cellulaire mechanismen te onderzoeken in foetale long cellen blootgesteld aan te rekken. Met behulp van deze benadering, heeft ons laboratorium geïdentificeerd verschillende receptoren en signalering eiwitten die in mechanotransductie deel te nemen aan foetale long ontwikkeling en longschade.
Protocol
Discussion
In dit manuscript beschrijven we een methode om foetale type II epitheelcellen en fibroblasten te isoleren en om ze bloot te stellen aan mechanische stimulatie met behulp van de Flexcell Strain Apparatus. We hebben gebruik gemaakt van deze techniek om differentiatie van epitheelcellen 1,2 beoordelen en receptor en signaalwegen geactiveerd door stretch 3-9 te bestuderen. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om cel responsen veroorzaakt door mechanische schade 10,11 onderzoeken. De p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ondersteund door NIH-subsidie HD052670.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5648 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130 | |
| Collagenase 1A | Sigma | C9891 | |
| Chicken serum | Sigma | C5405 | |
| Screen cups | Sigma | CD1-1KT | |
| Syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-25 | |
| 100 micron nylon mesh | Small Parts, INC | CMN-100-D | |
| 30 micron mesh | Small Parts, INC | CMN-30-D | |
| 15 micron mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX15 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen-1 | Collagen Biomed | PC0701 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Vitronectin | Sigma | V-0132 | |
| Elastin | Sigma | E-6402 | |
| Bioflex plate | Flexcell International | BF-3001U | Uncoated |
| Flexcell Strain Unit | Flexcell International | FX-5000 |
References
- Sanchez-Esteban, J., Tsai, S. W., Sang, J., Qin, J., Torday, J. S., Rubin, L. P. Effects of mechanical forces on lung-specific gene expression. Am. J. Med. Sci. 316, 200-204 (1998).
- Sanchez-Esteban, J., Cicchiello, L. A., Wang, Y., Tsai, S. W., Williams, L. K., Torday, J. S., Rubin, L. P. Mechanical stretch promotes alveolar epithelial type II cell differentiation. J. Appl. Physiol. 91, 589-595 (2001).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Gruppuso, P. A., Rubin, L. P. Mechanical stretch induces fetal type II cell differentiation via an epidermal growth factor receptor-extracellular-regulated protein kinase signaling pathway. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 30, 76-83 (2004).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Lee, N., Silbert, O., McKnight, N. L., Frangos, J. A. Strain-induced fetal type II epithelial cell differentiation is mediated via cAMP-PKA-dependent signaling pathway. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 291, L820-L827 (2006).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Filardo, E. J., Rubin, L. P., Ingber, D. E. Integrins {beta}1, {alpha}6, and {alpha}3 contribute to mechanical strain-induced differentiation of fetal lung type II epithelial cells via distinct mechanisms. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 290, L343-L350 (2006).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Soto-Reyes, D., Lee, H. S., Warburton, D., Sanchez-Esteban, J. Mechanical stretch promotes fetal type II epithelial cell differentiation via shedding of HB-EGF and TGF-alpha. J. Physiol. 587, 1739-1753 (2009).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Drouillard, D., Santos, M., Hokenson, M. A., Hawwa, R. L. A role for caveolin-1 in mechanotransduction of fetal type II epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 298, L775-L783 (2010).
- Lee, H. S., Wang, Y., Maciejewski, B. S., Esho, K., Fulton, C., Sharma, S. Interleukin-10 protects cultured fetal rat type II epithelial cells from injury induced by mechanical stretch. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 294, L225-L232 (2008).
- Hawwa, R. L., Hokenson, M. A., Wang, Y., Huang, Z., Sharma, S., Sanchez-Esteban, J. IL-10 inhibits inflammatory cytokines released by fetal mouse lung fibroblasts exposed to mechanical stretch. Pediatric Pulmonology. , (2011).
- Kitterman, J. A. The effects of mechanical forces on fetal lung growth. Clin. Perinatol. 23, 727-740 (1996).
- Harding, R., Crystal, R. G., West, J. B., Banes, P. J. Fetal breathing movements. The Lung: Scientific Fountations. , 2093-2104 (1997).
- Harding, R., Liggins, G. C. Changes in thoracic dimensions induced by breathing movements in fetal sheep. Reprod. Fertil. Dev. 8, 117-124 (1996).
