Summary
Prosedürü yağ ve mikroskobik manyetik rezonans elastografi (μMRE) kullanarak mekanik özelliklerini noninvaziv yerel değerlendirmesi yoluyla osteojenik doku mühendislik yapıları mühendislik sonucu izlemek için manyetik rezonans elastografi metodolojisi göstermektedir.
Abstract
Geleneksel mekanik bir test numunesinin genellikle tahribat sonuçlanır ve çalışmalar oluşturmak tasarlanmış, uzun süreli doku durumda, yıkıcı değerlendirmenin kullanımı kabul edilebilir değildir. Önerilen bir alternatif manyetik rezonans elastografi olarak adlandırılan bir görüntüleme işleminin kullanımı. Elastography bir doku yapısı ve işlevsellik belirlenmesi için gerekli işaretleyicilerdir yerel bir mekanik özellik değerleri (yani, karmaşık bir kayma modülü) ölçülmesi ile lamine sonucu belirlemek için bir geri dönüşlü bir yöntemdir. Değerlendirilmesi için noninvazif yolu olarak, manyetik rezonans görüntüleme (MRG) gibi görüntüleme yöntemleri ile mühendislik yapıların izlenmesi son on yılda 1 artan ilgi gördü. Örneğin, difüzyon ve relaxometry manyetik rezonans (MR) teknikleri mühendislik doku gelişimi 2 sırasında fiziksel ve kimyasal özelliklerinde değişiklikler karakterize etmek mümkün olmuştur. Önerilen yöntemaşağıdaki protokol küçük bir yumuşak dokuların 3 mekanik özelliklerini ölçmek için bir invaziv olmayan MR bazlı bir teknik olarak mikroskopik manyetik rezonans elastografi (μMRE) kullanır. MRE ilgili doku ile bir sonik mekanik tahrik kuplaj ve bir MR tarayıcı 4 ile kayma dalga yayılımı kayıt ile elde edilir. Son zamanlarda, μMRE geleneksel yıkıcı mekanik makroskopik teknikleri 5 ile ölçülür gerekli büyüme bilgi edinme doku mühendisliği uygulanmıştır. Aşağıdaki prosedürde, elastografi mekanik bir aktüatör ile birleştiğinde bir modifiye Hahn spin-eko sekansı ile mühendislik yapıları görüntüleme yoluyla elde edilir. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, modifiye sekansı dış kayma dalgaların iletimi ile görüntü toplama senkronize eder; daha sonra, hareketli bipolar çiftleri salınan kullanımı yoluyla sensitize olup. Olumlu ve olumsuz hareket sensitiza ile görüntülerin toplanması ardındanverilerin daha karmaşık bölümü bir kayma dalgası görüntü üretir. Sonra görüntü bir kayma rijitliği haritası 6 oluşturmak için bir inversiyon algoritması kullanılarak değerlendirilir. Her voksel az çıkan ölçümler güçlü veri dinamik mekanik analizi 7 kullanılarak toplanmıştır (R 2> 0,9914) ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmada, elastografi olarak Şekil 2'de gösterilmiştir adipogenic ve osteojenik yapıları içine insan mezenkimal kök hücre (h MSC) farklılaşma izlemek için doku gelişimi sürecine entegre edilmiştir.
Protocol
1. Doku Construct Hazırlık
Doku hazırlık süreci inşa üç ana aşamadan oluşmaktadır: kimyasal sinyal molekülleri aracılığıyla hücre popülasyonu genişlemesi, bir biyomateryal iskele üzerine hücrelerinin tohum ve farklılaşma. Yapı hazırlanması için işlem Dennis ve diğ., Hong ve ark. Ve Marion ve Mao 8,9,10 tarafından yapılan ölçümlere göre verilmiştir.
- Kültürü ve hücre hattı genişlemesi, tohum kemik ve 3x10 6 hücre / ml 'lik 1x10 6 hücre / ml' lik bir yoğunluğa bir jelatin sünger üzerine insan mezenkimal kök hücreleri (h MKH) (4 mm çapında, 3.5 mm kalınlığında) için sonra yağ oluşumu.
- Adipoz içine h MKH farklılaşma için, hücre büyüme ortamında 1 uM dekzametazon, 0.5 uM izobütil-metilksantin, 10 ug / ml insan rekombinant-insülini, ve 200 uM indometasin oluşan adipoz indüksiyon ortam uygulamakbir kez hücre iskele üzerinde birleşen görünür. Üç gün sonra, 10 mikrogram / 24 saat genişleme medya insan rekombinant insülin ml sonra indüksiyon medya dönmek ile medya değiştirin. Döngü üç kez tekrarlayın ve sonra da her iki günde bir bakım ortamı sadece alışverişi.
- Osteogenezisi indüklemek için, 0.1 uM dekzametazon, L-askorbik asit 2phosphate 50 uM, ve hücre genişletme ortamda 10 mM β-gliserofosfat bir son konsantrasyon yaparak osteojenik indüksiyon ortam hazırlanır. Taze osteojenik medya her iki günde bir değiştirin.
2. Aktüatör Karakterizasyonu
Aktüatör Karakterizasyonu MRE deney için hayati bir adımdır. MRE mekanik özelliklerin yerel değerleri değerlendirmek için mekanik bir kayma dalgaların yayılımı bağlıdır ve bu yüzden, bu mekanik bir piezoelektrik titreşim çalıştırıcı ile ilgili doku içinde üretilen ve karakterize edilmesi gerekir. Resimli bir exaKarakterizasyon işleminin mple Şekil 3 'de gösterilmiştir. Bu prosedür bir amacı, büyük amplitüdleri (~ 250 mikron) ile zararsız bir kayma dalgaları üretmek için bir çalıştırıcının harekete optimize etmektir.
- Deney öncesinde, bir 10 mm test tüpünde yapı içine% 0.5 agaroz jel uygulayın. Jel sıcaklığında olmalıdır yaklaşık 37 ° C oluşturmak için zararı en aza indirmek için.
- Agaroz jel beş dakika oda sıcaklığında ayarlamak için izin verildikten sonra, jel yüzey içine piezoelektrik bükme motorun ucu yerleştirin.
- Rijit bir destek için örnek ve tahrik içeren boru bağlayın ve şark mekanik Aktüatörün ucuna doğru Lazer Doppler vibrometreler bir ışın. Gerekirse yansıyan sinyal optimize etmek için, sistemin konumlandırma ayarlama, yansıtıcı şerit kullanabilir.
- Mekanik aktüatör beklenen rezonans frekansı dayanarak, d süpürüyor fonksiyon jeneratörü ayarlayınbeyaz bir gürültü sinyali ile 20 Vpp bir çalışma gerilimi kullanarak esired frekans aralığı (yani bu deney 20 ila 2000 Hz).
- Sistemin rezonans frekansı tespit etmek ve y ekseni olarak FFT ve hız için programı ayarlamak için Polytec Vibrosoft programı karakterize spektrum bilgileri.
- Deplasman ölçümü için, 200 Vpp bir çalışma voltajı kullanarak belirtilen rezonans frekansının sürekli sinüzoidin teslim aktüatör ayarlayın ve jel yüzeyine teslim edilmesini oluşturulan deplasman unutmayın. Y ekseni olarak deplasmanlı FFT gösterilecek Vibrosoft ayarlayın.
3. Görüntü Alma
- Aktüatör karakterizasyonu tamamladıktan sonra, MRI tarayıcı merkezinde örnek ve aktüatör yerleştirin. Doku yapı deneyler için, RF sinyal iletim ve alım için küçük ve daha hassas RF bobini (bu denemede yani 10 mm) kullanın. (Gösterilen prosedür, 9.4 T kullanandüşey delikli mıknatıs üç eksenli gradyanlar, 100 G / cm) ile donatılmıştır.
- Yapı yeri belirlenmesi için bir izci görüntü elde edin.
- Edinimi için parametreleri ayarlayın. In vitro sagital tarama tipik bir 1000 ms, 20-40 ms, 0.5-1.0 mm, 128x128 piksel matris boyutu 12x10 mm 2 Görüş dilim kalınlığı eko zaman bir tekrarı zamanınız olacak.
- Elastografi parametreler için, Lazer Doppler vibrometreler karakterizasyonu tarafından belirlenen değere tahrik frekans ayarlayın. Mevcut çalışmada, tek kutuplu çift 50 G / cm degrade genliği ile ihtiyaç vardı. Ayarlamak için Diğer parametreler ilk edinimi için sıfır milisaniye olarak ayarlanması gerekir gecikme içerir.
- Mod patlaması ve frekans ve devir sayısı dahil elastografi satın parametreleri bu maç için fonksiyon jeneratörü parametrelerini ayarlamak için fonksiyon jeneratörü değiştirin. Ayrıca, işlev ayarlamakTION jeneratör dışarıdan tetiklenir edilecek.
- Sagittal bir görüntü için, pozitif dilim yönde olmalı ve tarama başlatmak için hareket sensitizasyon ayarlayın. Satın alınmasının ardından, resmi kontrol ve negatif dilim yönüne sensitizasyon değiştirin.
- Kayma dalgası görüntü üretimi için karmaşık bölümü yapacak MATLAB programı çalıştırın.
- Makaslama dalgaları ve bu faz kaydırma mümkün eserlerin varlığı için görüntü değerlendirin.
- Görüntüye herhangi bir ayar gerekli ise, sıfır saniye ile karakterize rezonans frekansının tam bir döneme kadar sekiz eşit aralıklı değerleri parametre dizisi boyutunu ayarlamak.
- Pozitif ve negatif dilim yönelimleri hem de bir tarama elde edin.
- Görüntüleri elde edildikten sonra, görüntülerin bir diziden kayma dalgası veri üretmek için tasarlanmış bir MATLAB programı kullanın.
4. MRE Deney Görüntü İşleme
- ThMRE e son adım kayma dalgası görüntülerden kayma rijitliği hesaplamaktır. Üç boyutlu veri kümesi (2 uzaysal, 1 zamansal) değerlendirecektir MATLAB programı içine veri yerleştirilmesi.
Not: Bir düzlemsel kayma dalgası, yer değiştirme ve Laplace bir fonksiyonu olarak karmaşık değerli kayma modülü tahminine izin Ayrıştır hareket denklemlerinin üstlenerek. Algoritma sonlu fark ile mekansal ikinci türevleri yaklaşır ve bir piksel-piksel temelinde kayma modülü hesaplar. Bu karmaşık sayı itibaren, birçok mekanik parametrelerin algoritması sağlar gibi kayma dalgası hızı, dalga zayıflama, kayma rijitliği, kesme esneklik, kesme viskozitesi, vb gibi çıkarılabilir ilgi bölgelerinin seçimi kendisi için ortalama ve standart sapma Her parametre hesaplanır.
- Görüntüleme parametreleri programın başında belirtilen gerekir. Buna ek olarak, incielastogram e üst limit örnek kontrast optimize etmek için ayarlanabilmektedir.
Not: Program kullanıcıya kurtarma sadakat tahmin yardımcı ara sonuçları (low-pass filtre sonra dalga, yön filtreleme, zamansal FFT, çizgi profilleri, vb sonra dalga) sağlar.
- Bazı parametreler bu faiz, belirli bir bölgede bir parametre standart sapması ise alçak geçiren filtreler, hareket temporal frekansı, dalganın yayılma yönüne, vb düzeyleri gibi bu bilgilere dayanmaktadır ve ayarlanabilir Ayrıca hesaplamanın kalitesinin bir göstergesi.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 4 notları osteojenik ve adipogenic yapı gelişimi dört hafta boyunca mekanik özelliklerinde değişiklik. MRE 730-820 Hz yapıldı. Her iki numaralı seribaşı süngerler yaklaşık 3 kPa, osteogeni başladı ikenc yönlendirilmiş doku 22 kPa sertlik sonuçlandı; adipoz 1 kPa sertliği azalmış doku yönettiği, oysa. Ayrıca, osteojenik yapıları çalışmanın başından sonuna kıyasla boyutu belirgin bir azalma görülmüştür. Elastografi çalışmadan elde edilen ek özellikleri Tablo 1 'de gösterilmiştir.
Şekil 1. Manyetik rezonans elastografi için görüntü elde etme süreci. Görüntü alımı sırasında, bir darbe dizisi (a) (b) MRI tarayıcı bipolar gradyanlar darbeleri ile fonksiyon jeneratör senkronizasyonu kontrol eder. Olumlu ve olumsuz yönlerde toggled bipolar geçişlerini satın alınmasını takiben, (c) bir kayma dalgası görüntü karmaşık bir bölümü kullanılarak üretilir.
Doku motoru için MRE süreci Şekil 2. Akış şemasıered yapıları. İlk olarak, hücreler (a) ilk büyümüş ve tasarlanmış bir proje için gerekli nüfus boyutuna genişletilir. Daha sonra hücreler, bir biyomateryal iskelesi ve kimyasal reaktifler üzerine tohumlu (b) farklılaşma sinyallemek için uygulanan vardır. Iskelelerinin olan ilk adım (c) yapı ile birleştirilen bir çalıştırıcının rezonans frekansının belirlenmesidir MRE ile karakterize edilir. Sonra, MR görüntüleri (d) bir kayma dalgası görüntü (e) oluşturmak için elde edilir. Son olarak, bir algoritma bir elastogram oluşturmak için uygulanmıştır (f) eşleyen yapının sertliği. Aynı zamanda, yapıları farklılaşmayı doğrulamak için histolojik değerlendirmesi (g) kesitler vardır.
Şekil 3. Aktüatör karakterizasyonu prosedürü. Jelatin iskele% 0.5 agaroz jel tarafından eklenmiştir. Örnek olarak aktarıldığı hareket karakterize etmek için, beyaz bir gürültü birinci sistemi içine gönderilir(1a) ve ortaya çıkan hareket, bir Lazer Doppler vibrometreler (1b) ile tespit edilir. Rezonans frekansı belirlendikten sonra, rezonans azından bir sürekli sinüzoidin sinyali (2a) jelatin ortamına aktarılmıştır yerinden (2b) belirlemek için gönderilir.
Şekil 4. Dört haftalık süre içinde geliştirme haritası oluşturun. Adipogenic (A) ve osteojenik (O) yapıları soldan gelen büyüklük ve kayma dalgası görüntüleri, elastogram ve ortalama kayma rijitliği ile doğru gösterilir. Çubuk grafik ve hata çubukları renk düzeni ile elastogram karşılık gelir renk haritası ilgi her yapı Kullanıcı bölgede standart sapmayı temsil eder.
Tablo 1. Büyümenin dört hafta süresince yağ ve osteo yapıları mekanik özellikleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu prosedürde, doku lamine yapılar için MRE işlemi hücre hazırlanması bir elastogram üretilmesi için gösterilmiştir. Doku mühendisliği boru hattına bir zarar vermeden mekanik değerlendirme yöntemi uygulayarak, bu gelişme birden aşamalarında mühendislik yapıları değişimleri değerlendirmek artık mümkün. Mühendislik izleme doku gibi difüzyon, mıknatıslanma transferi ve kimyasal kayma analizi 1 oluşumları için ek olarak, MRE diğer MR yöntemleri tamamlar.
MRE deneyler, bir kaç sınırlama not edilmelidir. In vitro örneklerinde değerlendirilmesi zamana duyarlı çalışmadır. Bu nedenle, bu doku oluşturmak için herhangi bir olası hasara en aza indirilir, böylece çalışmaları, birden fazla saat boyunca yeterli tavsiye edilir. Ayrıca, sertlik haritası sadık kurtarma 6 çok küçük ya da sert olmak yapıları nedeniyle tehlikeye girebilir. ÜzerindeDalga boyu frekansı ile ters orantılı olduğu için, bu soruna bir çözüm e mümkündür, yüksek frekans (> 2,5 kHz) çalışmasına etmektir. Yüksek gerilim amplifikatörler tarafından sürülürler Piezoelektrik aktüatörler yığın örnek tam bir kayma dalga üretmek için bu frekanslarda yeterli hareket teslim edebiliyoruz. Protokole Başka bir olası değişikliği, bu spin-eko hızlı ve eko planar görüntüleme 11, 12 gibi daha hızlı dizileri kullanmaktır.
In vitro doku mühendisliği yapıları için MRE olanakları ötesinde, klinik öncesi değerlendirme sonraki adım yaşayan bir sistem içine implante dokuların gelişimini değerlendirmektir. Fare çalışmalara MRE uygulaması nondestructively geliştirme doku yapıları değerlendirmek için bir fırsat sağlayacaktır. Kemik veya kıkırdak hasarlarının tedavisi için elastografi uzatılması potansiyel olarak daha uzun ömürlü fonksiyonel implantlar f üretmek için nasıl daha iyi anlaşılmasını sağlayacakveya rejeneratif tıpta kullanın. Manyetik rezonans elastografi in vitro ve in vivo hem de mühendislik yapıları doğrulama artan bir rol oynama potansiyeline sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa Çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Bu araştırma NIH RO3'ü-EB007299-02 ve NSF EPSCoR Birincilik Ödülü kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MSCGM-Bullet Kit | Reagent | Lonza Inc. | PT-3001 | Store at 4°C |
| 1X DPBS | Reagent | Invitrogen | 21600-010 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | Store at -20°C |
| Dexamethasone | Reagent | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Reagent | Sigma-Aldrich | I5879 | Store at -20°C |
| Insulin-bovine pancreas | Reagent | Sigma-Aldrich | I6634 | Store at -20°C |
| Indomethacin | Reagent | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Β-Glycerophosphate | Reagent | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Reagent | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Gelfoam | Scaffold | Pharmacia Corporation (Pfizer) | 09-0315-08 | |
| Human mesenchymal stem cells | Cell Line | Lonza Inc. | PT-2501 | |
| 9.4T MR Scanner | Equipment | Agilent Technologies | 400MHz WB | |
| 10mm Litz Coil | Equipment | Doty Scientific | ||
| Laser Doppler Vibrometer | Equipment | Polytec | PDV-100 | |
| Vibrosoft (20) | Software | Polytec | ||
| Function generator | Equipment | Agilent Technologies | AFG 3022B | |
| Amplifier | Equipment | Piezo Inc. | EPA-104-115 | |
| Piezo Bending motor | Equipment | Piezo Inc. | T234-A4Cl-203X | |
| Computer-Linux | Equipment | Intel | Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G | |
| Computer-Windows | Equipment | Intel | Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G | |
| MATLAB | Software | Mathworks | 2009b |
References
- Xu, H., Othman, S. F., Magin, R. L. Monitoring tissue engineering using magnetic resonance imaging. J. Biosci. Bioeng. 106, 515-527 (2008).
- Xu, H., Othman, S. F., Hong, L., Peptan, I. A., Magin, R. L. Magnetic resonance microscopy for monitoring osteogenesis in tissue-engineered construct in vitro. Phys. Med. Biol. 51, 719-732 (2006).
- Othman, S. F., Xu, H., Royston, T. J., Magin, R. L. Microscopic magnetic resonance elastography (microMRE. Magn. Reson. Med. 54, 605-615 (2005).
- Muthupillai, R., Lomas, D. J., Rossman, P. J., Greenleaf, J. F., Manduca, A., Ehman, R. L. Magnetic resonance elastography by direct visualization of propagating acoustic strain waves. Science. 269, 1854-1857 (1995).
- Othman, S. F., Curtis, E. T., Plautz, S. A., Pannier, A. P., Xu, H. Magnetic resonance elastography monitoring of tissue engineered constructs. NMR Biomed. , Forthcoming (2011).
- Oliphant, T. E., Manduca, A., Ehman, R. L., Greenleaf, J. F. Complex-valued stiffness reconstruction for magnetic resonance elastography by algebraic inversion of the differential equation. Magn. Reson. Med. 45, 299-310 (2001).
- Ringleb, S. I., Chen, Q., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L., An, K. Quantitative shear wave: comparison to a dynamic shear material test. Magn. Reson. Med. 53, 1197-1201 (2005).
- Hong, L., Peptan, I., Clark, P., Mao, J. J. Ex vivo adipose tissue engineering by human marrow stromal cell seeded gelatin sponge. Ann. Biomed. Eng. 33, 511-517 (2005).
- Dennis, J. E., Haynesworth, S. E., Young, R. G., Caplan, A. I. Osteogenesis in marrow-derived mesenchymal cell porous ceramic composites transplanted subcutaneously: effect of fibronectin and laminin on cell retention and rate of osteogenic expression. Cell Transplant. 1, 23-32 (1992).
- Marion, N. W., Mao, J. J. Mesenchymal stem cells and tissue engineering. Methods Enzymol. 420, 339-361 (2006).
- Rydberg, J., Grimm, R., Kruse, S., Felmlee, J., McCracken, P., Ehman, R. L. Fast spin-echo magnetic resonance elastography of the brain. Proceedings of the International Society of Magnetic Resonance in Medicine, Glasgow, Scotland, , 1647-1647 (2001).
- Kruse, S. A., Grim, R. C., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L. Fast EPI based 3D MR elastography of the brain. Proceedings of the International Society for Magnetic Resonance in Medicine, Seattle, Washington, , 3385-3385 (2006).
