In vitro metingen van Tracheale Vernauwing bij muizen
Summary
Transgene muizen zijn zeer nuttig in het toeschrijven van een fysiologische functie van genen. Als zodanig onderzoek in het algemeen, en functionele studies van de luchtwegen, in het bijzonder, hebben ondergaan een opmerkelijke verschuiving in de richting van muismodellen. Hier voorzien protocollen<em> In vitro</em> Luchtpijp vernauwing studies om een soepele spierfunctie in muriene luchtwegen te evalueren.
Abstract
Transgene en knock-out muizen zijn krachtige tools voor het onderzoek van de fysiologie en pathofysiologie van de luchtwegen 1,2. In vitro tensometry van geïsoleerde tracheapreparaten heeft bewezen een bruikbare test van de luchtweg-gladde spier (ASM) contractiele respons in genetisch gemodificeerde muizen zijn. Deze in vitro tracheapreparaten zijn relatief eenvoudig, zorgen voor een stevige reactie, en behouden van zowel functionele cholinerge zenuwuiteinden en spieren reacties, zelfs na lange incubaties.
Tracheale tensometry biedt ook een functioneel onderzoek naar verschillende second messenger signaalwegen dat contractie van glad spierweefsel invloed bestuderen. Contractie in de luchtpijp wordt voornamelijk gemedieerd door parasympathische, cholinerge zenuwen die acetylcholine los op ASM (figuur 1). De belangrijkste ASM acetylcholine receptoren zijn muscarine M2 en M3 die zijn G i / o en GQ gekoppelde receptoren, respectievelijk <sup> 3,4,5. M3-receptoren op te roepen krimp door het koppelen aan Gq aan fosfolipase C, verhoging van IP3 de productie en de IP3-gemedieerde calcium vrijstelling uit het sarcoplasmatisch reticulum 3,6,7 te activeren. M2 / G i / o signalering wordt dat contracties verbeteren door remming van adenylaatcyclase leidt tot een afname van cAMP 5,8,9,10. Deze wegen vormen de zogenaamde "farmaco-contractie koppeling" van de luchtweg-gladde spier 11. Bovendien cholinerge signalering via M2 receptoren (gemoduleerd door M3 signaal) omvat signaalwegen die de ASM die op zijn beurt activeren L-type, voltage-afhankelijk calcium kanalen (figuur 1) en calciuminflux (zogenaamde "excitatie-contractie" depolariseren ) 4,7. Meer gedetailleerde recensies over signaalwegen het regelen van luchtwegvernauwing kan worden gevonden 4,12. De bovenstaande paden lijken te zijn geconserveerd tussen muizen en andere soorten. Echter, de muis luchtpijpen verschillen van andere soorten in een aantal signaalwegen. Het meest prominent is hun gebrek aan contractiele respons op histamine en adenosine 13,14, zowel bekende ASM modulatoren in mensen en andere soorten 5,15.
Hier dienen protocollen voor de isolatie van muizen tracheale ring en de in vitro meten van de contractiele output. Inbegrepen zijn beschrijvingen van de apparatuur configuratie, de luchtpijp ring isolatie en contractiele metingen. Voorbeelden worden gegeven voor het oproepen van contracties indirect met behulp van hoge kalium stimulatie van zenuwen en rechtstreeks door depolarisatie van ASM spier om voltage-afhankelijke calcium influx te activeren (1. Hoge K +, figuur 1). Daarnaast worden methoden beschreven voor stimulatie zenuwen alleen door elektrische veld stimulatie (2. EFS, figuur 1), of directe stimulatie van ASM spier gebruik van exogene neurotransmitter bij het bad (3. Exogene ACH figuur 1). Dit FLExibility en gemakkelijke bereiding maakt de geïsoleerde trachea ring model een robuust en functionele assay voor een aantal signaleringscascades betrokken luchtweg gladde spieren.
Protocol
Discussion
Het protocol hier gepresenteerde biedt een fysiologische voorbereiding op de luchtwegen spierfunctie te beoordelen. Wij over het algemeen 3-4 orgel badpreparaten gelijktijdig te werken, echter, voorverpakte systemen zijn verkrijgbaar bij een aantal leveranciers dat de gelijktijdige metingen van maximaal 8 preparaten (ADInstruments, World precisie-instrumenten, en Harvard Apparatus) mogelijk te maken. We hebben gebruik gemaakt van een aantal krachtopnemers en weefsel orgaan baden met gelijkwaardige resultaten opleveren. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van het Centrum voor Innovatie in preventie en behandeling van aandoeningen van de luchtwegen, NINDS-subsidie (NS052574), en van de Sandler-programma voor astma Research.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Analogue-Digital Converter | ADInstruments | PowerLab 4/35 | |
| Carbachol (Carbamoylcholine Chloride) | Sigma-Aldrich | C4832 | 10-2 M in water (aliquots can be stored at -20°C) |
| Charting Software | ADInstrtuments | LabChart | |
| Heating Circulator | Haake | Mixer Mill MM400 | |
| Isometric Force Transducer | Kent Scientific | TRN001 | |
| Stimulator | Grass Technologies | S88 Dual Output Square Pulse Stimulator | |
| Tissue Bath | WPI | 47264 |
References
- Lloyd, C. M. Building better mouse models of asthma. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 231-236 (2007).
- Hausding, M., Sauer, K., Maxeiner, J. H., Finotto, S. Transgenic models in allergic responses. Curr. Drug Targets. 9, 503-510 (2008).
- Eglen, R. M., Hegde, S. S., Watson, N. Muscarinic receptor subtypes and smooth muscle function. Pharmacol Rev. 48, 531-565 (1996).
- Ehlert, F. J. Contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in gastrointestinal, airway and urinary bladder smooth muscle. Life Sci. 74, 355-366 (2003).
- Hall, I. P. Second messengers, ion channels and pharmacology of airway smooth muscle. Eur. Respir. J. 15, 1120-1127 (2000).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Ehlert, F. J. Pharmacological analysis of the contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in smooth muscle. Receptors Channels. 9, 261-277 (2003).
- Sankary, R. M., Jones, C. A., Madison, J. M., Brown, J. K. Muscarinic cholinergic inhibition of cyclic AMP accumulation in airway smooth muscle. Role of a pertussis toxin-sensitive protein. Am. Rev. Respir Dis. 138, 145-150 (1988).
- Widdop, S., Daykin, K., Hall, I. P. Expression of muscarinic M2 receptors in cultured human airway smooth muscle cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 9, 541-546 (1993).
- Karaki, H. Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle. Pharmacol. Rev. 49, 157-230 (1997).
- Somlyo, A. V., Somlyo, A. P. Electromechanical and pharmacomechanical coupling in vascular smooth muscle. J. Pharmacol Exp. Ther. 159, 129-145 (1968).
- Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Muscarinic receptors and control of airway smooth muscle. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158, 154-160 (1998).
- Fernandez-Rodriguez, S., Broadley, K. J., Ford, W. R., Kidd, E. J. Increased muscarinic receptor activity of airway smooth muscle isolated from a mouse model of allergic asthma. Pulm. Pharmacol. Ther. 23, 300-307 (2010).
- Garssen, J., Loveren, H. V. a. n., Van Der Vliet, H., Nijkamp, F. P. An isometric method to study respiratory smooth muscle responses in mice. J. Pharmacol. Methods. 24, 209-217 (1990).
- Vass, G., Horvath, I. Adenosine and adenosine receptors in the pathomechanism and treatment of respiratory diseases. Curr. Med. Chem. 15, 917-922 (2008).
- Borchers, M. T. Methacholine-induced airway hyperresponsiveness is dependent on Galphaq signaling. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 285, 114-120 (2003).
- Sausbier, M. Reduced rather than enhanced cholinergic airway constriction in mice with ablation of the large conductance Ca2+-activated K+ channel. Faseb. J. 21, 812-822 (2007).
- Scheerens, H. Long-term topical exposure to toluene diisocyanate in mice leads to antibody production and in vivo airway hyperresponsiveness three hours after intranasal challenge. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 159, 1074-1080 (1999).
- Kenakin, T. P. . A pharmacology primer : theory, applications, and methods. , (2009).
- Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. BK Channel {beta}1 Subunits Regulate Airway Contraction Secondary to M2 Muscarinic Acetylcholine Receptor Mediated Depolarization. J. Physiol. , 1803-1817 (2011).
- Moffatt, J. D., Cocks, T. M., Page, C. P. Role of the epithelium and acetylcholine in mediating the contraction to 5-hydroxytryptamine in the mouse isolated trachea. Br. J. Pharmacol. 141, 1159-1166 (2004).
- Bachar, O., Adner, M., Uddman, R., Cardell, L. O. Nerve growth factor enhances cholinergic innervation and contractile response to electric field stimulation in a murine in vitro model of chronic asthma. Clin. Exp. Allergy. 34, 1137-1145 (2004).
- Weigand, L. A., Myers, A. C., Meeker, S., Undem, B. J. Mast cell-cholinergic nerve interaction in mouse airways. J. Physiol. 587, 3355-3362 (2009).
- Kao, J., Fortner, C. N., Liu, L. H., Shull, G. E., Paul, R. J. Ablation of the SERCA3 gene alters epithelium-dependent relaxation in mouse tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. 277, 264-270 (1999).
- Krane, C. M. Aquaporin 5-deficient mouse lungs are hyperresponsive to cholinergic stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 14114-14119 (2001).
- Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. BK channel beta1-subunit regulation of calcium handling and constriction in tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 291, L802-L810 (2006).
- Fortner, C. N., Breyer, R. M. EP2 receptors mediate airway relaxation to substance P ATP, and PGE2. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, 469-474 (2001).
- Hay, D. W. Differential modulation of endothelin ligand-induced contraction in isolated tracheae from endothelin B (ET(B)) receptor knockout mice. Br. J. Pharmacol. 132, 1905-1915 (2001).
- Stengel, P. W., Yamada, M., Wess, J., Cohen, M. L. M(3)-receptor knockout mice: muscarinic receptor function in atria, stomach fundus, urinary bladder, and trachea. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp Physiol. 282, R1443-R1449 (2002).
- Trevisani, M. Evidence for in vitro expression of B1 receptor in the mouse trachea and urinary bladder. Br. J. Pharmacol. 126, 1293-1300 (1038).
- Mehats, C. PDE4D plays a critical role in the control of airway smooth muscle contraction. FASEB J. 17, 1831-1841 (2003).
- Kumar, R. K., Herbert, C., Foster, P. S. The “classical” ovalbumin challenge model of asthma in mice. Curr. Drug Targets. 9, 485-494 (2008).
