In-vitro-Messungen des Tracheal Zusammenziehen mit Mäusen
Summary
Transgene Mäuse sind äußerst nützlich bei der Zuschreibung physiologischen Funktion von Genen. Als solcher Forschung im Allgemeinen und funktionelle Untersuchungen der Atemwege, insbesondere, haben eine bemerkenswerte Verschiebung hin zu Mausmodellen unterzogen. Hier bieten wir Protokolle zur<em> In-vitro-</em> Luftröhre Verengung Studien zur Bewertung der Funktion der glatten Muskulatur in murinen Atemwegen.
Abstract
Transgene und Knockout-Mäusen wurden leistungsfähige Werkzeuge für die Untersuchung der Physiologie und Pathophysiologie der Atemwege 1,2. In-vitro-tensometry von isolierten trachealen Vorbereitungen hat sich als nützlich Assay von glatten Muskelzellen der Atemwege (ASM) kontraktilen Antwort in gentechnisch veränderten Mäusen zu sein. Diese In-vitro tracheale Vorbereitungen sind relativ einfach, bieten eine robuste Antwort, und bewahren Sie sowohl funktionale cholinerge Nervenenden und Muskeln Antworten, auch nach langen Inkubationen.
Tracheale tensometry sowie als funktionelle Assays, um eine Vielzahl von Second-Messenger-Signalwege, die Kontraktion der glatten Muskulatur betreffen studieren. Kontraktion in der Luftröhre ist in erster Linie durch parasympathische, cholinerge Nerven, dass Acetylcholin freisetzen auf ASM (1) vermittelt. Die wichtigsten ASM Acetylcholin-Rezeptoren sind muskarinischen M2 und M3, G i / o und Gq gekoppelten Rezeptoren, die jeweils sind <sup> 3,4,5. M3-Rezeptoren hervorrufen Kontraktion durch Kopplung an Gq an Phospholipase C, Anstieg IP3 Produktions-und IP3-vermittelte Calcium-Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum 3,6,7 aktivieren. M2 / G i / o-Signalisierung wird angenommen, dass Kontraktionen durch Hemmung der Adenylatcyclase, was zu einer Abnahme der cAMP-Spiegel 5,8,9,10 erweitern. Diese Wege bilden die so genannten "Pharmako-Kopplung Kontraktion" der glatten Muskulatur der Atemwege 11. Darüber hinaus beinhaltet cholinergen Signalisierung durch M2-Rezeptoren (und moduliert durch M3-Signalisierung) Wege, die die ASM, die wiederum aktivieren L-Typ, spannungsabhängige Kalziumkanäle (Abbildung 1) und Calcium-Einstrom (so genannte "Erregung und Kontraktion" depolarisieren ) 4,7. Detailliertere Bewertungen auf Signalwege steuern Verengung der Atemwege können 4,12 gefunden werden. Die obigen Wege scheinen zwischen Maus und anderen Spezies konserviert werden. Allerdings unterscheiden sich Maus Luftröhre aus anderen Spezies in einige Signalwege. Am bekanntesten ist ihr Mangel an kontraktilen Antwort auf Histamin und Adenosin 13,14, beide bekannte ASM-Modulatoren in Menschen und anderen Spezies 5,15.
Hier stellen wir Protokolle für die Isolierung von murinen Trachealringe und die in vitro-Messung ihrer kontraktilen ausgegeben. Enthalten sind Beschreibungen der Geräte-Konfiguration, Luftröhre Ring Isolation und kontraktilen Messungen. Es werden Beispiele für evozieren Kontraktionen indirekt mit hohem Kalium-Stimulation von Nerven und direkt durch Depolarisation von ASM Muskel zu spannungsabhängigen Calcium-Einstrom aktivieren gegeben (1. Hohe K +, Abbildung 1). Darüber hinaus werden Methoden zur Stimulation von Nerven allein mit elektrischen Feldes Stimulation (2. EFS, Abbildung 1), oder für eine direkte Stimulation der Muskulatur ASM mit exogenen Neurotransmitter, die auf die Badewanne (3. Exogene ACH, Abbildung 1) vorgestellt. Dieses flexibilität und Leichtigkeit der Herstellung macht das isolierte Trachea Ring-Modell eine robuste und funktionelle Assays für eine Vielzahl von Signalwegen in den Atemwegen Kontraktion der glatten Muskulatur beteiligt.
Protocol
Discussion
Das hier vorgestellte Protokoll bietet eine physiologische Vorbereitung der Atemwege Muskelfunktion zu beurteilen. Wir arbeiten in der Regel 3-4 Organbad Präparate gleichzeitig aber sind vorgefertigte Systeme aus einer Reihe von Anbietern, die simultane Messung von bis zu 8 Zubereitungen (ADInstruments, World Precision Instruments, und Harvard Apparatus) erlauben verfügbar. Wir haben eine Reihe von Kraftaufnehmern und Gewebe Organbäder mit gleichwertigen Ergebnissen genutzt. Allerdings finden wir, dass elektrische Fe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem Zentrum für Innovation in der Prävention und Behandlung von Atemwegserkrankungen, NINDS Grant (NS052574), und von der Sandler-Programm für Asthma-Forschung finanziert.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Analogue-Digital Converter | ADInstruments | PowerLab 4/35 | |
| Carbachol (Carbamoylcholine Chloride) | Sigma-Aldrich | C4832 | 10-2 M in water (aliquots can be stored at -20°C) |
| Charting Software | ADInstrtuments | LabChart | |
| Heating Circulator | Haake | Mixer Mill MM400 | |
| Isometric Force Transducer | Kent Scientific | TRN001 | |
| Stimulator | Grass Technologies | S88 Dual Output Square Pulse Stimulator | |
| Tissue Bath | WPI | 47264 |
References
- Lloyd, C. M. Building better mouse models of asthma. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 231-236 (2007).
- Hausding, M., Sauer, K., Maxeiner, J. H., Finotto, S. Transgenic models in allergic responses. Curr. Drug Targets. 9, 503-510 (2008).
- Eglen, R. M., Hegde, S. S., Watson, N. Muscarinic receptor subtypes and smooth muscle function. Pharmacol Rev. 48, 531-565 (1996).
- Ehlert, F. J. Contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in gastrointestinal, airway and urinary bladder smooth muscle. Life Sci. 74, 355-366 (2003).
- Hall, I. P. Second messengers, ion channels and pharmacology of airway smooth muscle. Eur. Respir. J. 15, 1120-1127 (2000).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Ehlert, F. J. Pharmacological analysis of the contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in smooth muscle. Receptors Channels. 9, 261-277 (2003).
- Sankary, R. M., Jones, C. A., Madison, J. M., Brown, J. K. Muscarinic cholinergic inhibition of cyclic AMP accumulation in airway smooth muscle. Role of a pertussis toxin-sensitive protein. Am. Rev. Respir Dis. 138, 145-150 (1988).
- Widdop, S., Daykin, K., Hall, I. P. Expression of muscarinic M2 receptors in cultured human airway smooth muscle cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 9, 541-546 (1993).
- Karaki, H. Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle. Pharmacol. Rev. 49, 157-230 (1997).
- Somlyo, A. V., Somlyo, A. P. Electromechanical and pharmacomechanical coupling in vascular smooth muscle. J. Pharmacol Exp. Ther. 159, 129-145 (1968).
- Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Muscarinic receptors and control of airway smooth muscle. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158, 154-160 (1998).
- Fernandez-Rodriguez, S., Broadley, K. J., Ford, W. R., Kidd, E. J. Increased muscarinic receptor activity of airway smooth muscle isolated from a mouse model of allergic asthma. Pulm. Pharmacol. Ther. 23, 300-307 (2010).
- Garssen, J., Loveren, H. V. a. n., Van Der Vliet, H., Nijkamp, F. P. An isometric method to study respiratory smooth muscle responses in mice. J. Pharmacol. Methods. 24, 209-217 (1990).
- Vass, G., Horvath, I. Adenosine and adenosine receptors in the pathomechanism and treatment of respiratory diseases. Curr. Med. Chem. 15, 917-922 (2008).
- Borchers, M. T. Methacholine-induced airway hyperresponsiveness is dependent on Galphaq signaling. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 285, 114-120 (2003).
- Sausbier, M. Reduced rather than enhanced cholinergic airway constriction in mice with ablation of the large conductance Ca2+-activated K+ channel. Faseb. J. 21, 812-822 (2007).
- Scheerens, H. Long-term topical exposure to toluene diisocyanate in mice leads to antibody production and in vivo airway hyperresponsiveness three hours after intranasal challenge. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 159, 1074-1080 (1999).
- Kenakin, T. P. . A pharmacology primer : theory, applications, and methods. , (2009).
- Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. BK Channel {beta}1 Subunits Regulate Airway Contraction Secondary to M2 Muscarinic Acetylcholine Receptor Mediated Depolarization. J. Physiol. , 1803-1817 (2011).
- Moffatt, J. D., Cocks, T. M., Page, C. P. Role of the epithelium and acetylcholine in mediating the contraction to 5-hydroxytryptamine in the mouse isolated trachea. Br. J. Pharmacol. 141, 1159-1166 (2004).
- Bachar, O., Adner, M., Uddman, R., Cardell, L. O. Nerve growth factor enhances cholinergic innervation and contractile response to electric field stimulation in a murine in vitro model of chronic asthma. Clin. Exp. Allergy. 34, 1137-1145 (2004).
- Weigand, L. A., Myers, A. C., Meeker, S., Undem, B. J. Mast cell-cholinergic nerve interaction in mouse airways. J. Physiol. 587, 3355-3362 (2009).
- Kao, J., Fortner, C. N., Liu, L. H., Shull, G. E., Paul, R. J. Ablation of the SERCA3 gene alters epithelium-dependent relaxation in mouse tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. 277, 264-270 (1999).
- Krane, C. M. Aquaporin 5-deficient mouse lungs are hyperresponsive to cholinergic stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 14114-14119 (2001).
- Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. BK channel beta1-subunit regulation of calcium handling and constriction in tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 291, L802-L810 (2006).
- Fortner, C. N., Breyer, R. M. EP2 receptors mediate airway relaxation to substance P ATP, and PGE2. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, 469-474 (2001).
- Hay, D. W. Differential modulation of endothelin ligand-induced contraction in isolated tracheae from endothelin B (ET(B)) receptor knockout mice. Br. J. Pharmacol. 132, 1905-1915 (2001).
- Stengel, P. W., Yamada, M., Wess, J., Cohen, M. L. M(3)-receptor knockout mice: muscarinic receptor function in atria, stomach fundus, urinary bladder, and trachea. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp Physiol. 282, R1443-R1449 (2002).
- Trevisani, M. Evidence for in vitro expression of B1 receptor in the mouse trachea and urinary bladder. Br. J. Pharmacol. 126, 1293-1300 (1038).
- Mehats, C. PDE4D plays a critical role in the control of airway smooth muscle contraction. FASEB J. 17, 1831-1841 (2003).
- Kumar, R. K., Herbert, C., Foster, P. S. The “classical” ovalbumin challenge model of asthma in mice. Curr. Drug Targets. 9, 485-494 (2008).
