Em medições in vitro de constrição traqueal Utilizando camundongos
Summary
Camundongos transgênicos têm sido extremamente úteis em atribuir função fisiológica para genes. Como a pesquisa, tal em geral, e estudos funcionais da via aérea, em particular, têm sofrido uma mudança notável na direção modelos murinos. Aqui nós fornecemos os protocolos para<em> In vitro</em> Estudos de constrição da traqueia para avaliar a função do músculo liso das vias aéreas em camundongos.
Abstract
Transgênicos e camundongos têm sido ferramentas poderosas para a investigação da fisiologia e fisiopatologia das vias aéreas 1,2. Em tensometry in vitro de preparações isoladas traqueal provou ser um teste útil do músculo liso das vias aéreas (ASM) resposta contrátil em camundongos geneticamente modificados. Estes em preparações in vitro da traquéia são relativamente simples, dar uma resposta robusta e manter ambas as terminações nervosas colinérgicas funcionais e respostas musculares, mesmo após longas incubações.
Tensometry traqueal também fornece um ensaio funcional para estudar uma variedade de vias de sinalização de segundo mensageiro que afectam a contração do músculo liso. Contração na traquéia é mediado principalmente pela parassimpático, nervos colinérgicos que liberam acetilcolina em ASM (Figura 1). Os principais receptores de acetilcolina ASM são M2 e M3 muscarínicos que são G i / o e receptores acoplados Gq, respectivamente <sup> 3,4,5. Receptores M3 evocar a contração de acoplamento para Gq para ativar a fosfolipase C, aumentam a produção de IP3 e IP3 mediado pela liberação de cálcio do retículo sarcoplasmático 3,6,7. M2 / g de I / O de sinalização é acreditado para melhorar as contracções por inibição da adenilato-ciclase levando a uma diminuição dos níveis de cAMP 5,8,9,10. Estes percursos constituem o chamado "acoplamento fármaco-contração" do músculo liso das vias aéreas 11. Além disso, a sinalização através de receptores colinérgicos M2 (e modulada por M3 sinalização) envolve vias que despolarizar a ASM que por sua vez activar tipo L, canais de cálcio dependentes de tensão (Figura 1) e influxo de cálcio (o chamado "acoplamento excitação-contração" ) 4,7. Comentários mais detalhados sobre as vias de sinalização que controlam a constrição das vias aéreas pode ser encontrado 4,12. As vias acima parecem ser conservados entre os ratos e outras espécies. No entanto, traqueias de rato difere de outras espécies in alguns vias de sinalização. O mais proeminente é a falta de resposta contrátil a 13,14 histamina e adenosina, ambos os moduladores conhecidos ASM em seres humanos e outras espécies 5,15.
Apresentamos aqui protocolos para o isolamento de murinos anéis traqueais e as medições in vitro da sua saída contráctil. Incluem-se as descrições da configuração do equipamento, traquéia isolamento anel e medições contráteis. Exemplos são apresentados para evocar contracções indirectamente, utilizando estimulação de potássio elevado de nervos e directamente por despolarização de músculo ASM para activar e dependente da voltagem influxo de cálcio (1. Alta K +, Figura 1). Além disso, os métodos são apresentados para estímulos de nervos sozinho usando estimulação do campo eléctrico (2. EFS, Figura 1), ou para a estimulação directa de músculo ASM usando neurotransmissor exógeno aplicado ao banho (3. Exógeno ACH, Figura 1). Este flexibility e facilidade de preparação processa o modelo de anel isolado da traqueia de um ensaio robusto e funcional para um número de cascata de sinalização envolvidas na contracção do músculo liso das vias aéreas.
Protocol
Discussion
O protocolo apresentado aqui proporciona uma preparação fisiológica para avaliar a função muscular das vias aéreas. Nós operam geralmente preparações para o banho de órgãos de 3-4 simultaneamente, no entanto, os sistemas de pré-embalados estão disponíveis a partir de um certo número de fornecedores que permitem medições simultâneas de até 8 preparações (ADInstruments, instrumentos de precisão do mundo, e Harvard Apparatus). Foi utilizado um número de transdutores de força e banhos de órgãos de …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por uma doação do Centro para a Inovação na Prevenção e Tratamento de doenças respiratórias, NINDS concessão (NS052574), e do Programa de Pesquisa Sandler Asma.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Analogue-Digital Converter | ADInstruments | PowerLab 4/35 | |
| Carbachol (Carbamoylcholine Chloride) | Sigma-Aldrich | C4832 | 10-2 M in water (aliquots can be stored at -20°C) |
| Charting Software | ADInstrtuments | LabChart | |
| Heating Circulator | Haake | Mixer Mill MM400 | |
| Isometric Force Transducer | Kent Scientific | TRN001 | |
| Stimulator | Grass Technologies | S88 Dual Output Square Pulse Stimulator | |
| Tissue Bath | WPI | 47264 |
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