מלוטשת מחוזק דליל, הגולגולת חלון הדמיה לטווח ארוך של מוח עכבר
Summary
אנו מציגים שיטה ליצירת חלון הדמיה בגולגולת העכבר החובקת מילימטרים והוא יציב במשך חודשים ללא דלקת של המוח. שיטה זו גם מתאים מחקרים ארוכי טווח של זרימת דם, דינמיקה סלולריים, ותא / מבנה כלי הדם באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ.
Abstract
In vivo הדמיה של תפקוד קליפת המוח דורש גישה אופטית למוח ללא הפרעה של הסביבה תוך גולגולתי. אנו מציגים שיטה ליצירת הגולגולת דליל מלוטשת מחוזק (יציאות) חלון בגולגולת העכבר החובקת כמה מילימטרים בקוטר והוא יציב במשך חודשים. הגולגולת הוא דליל עד 10 עד 15 מיקרומטר עובי עם יד שנערך תרגיל כדי להשיג בהירות אופטית, והוא מעולף ואז עם דבק cyanoacrylate וכוס כיסוי ל: 1) לספק קשיחות, 2) לעכב לצמיחה מחודשת העצם 3) להפחית את פיזור אור מ חריגות על פני העצם. מאז הגולגולת לא פרוץ, דלקת העלולה להשפיע על תהליך הנלמד מופחת במידה ניכרת. בעומק הדמיה של עד 250 מיקרומטר מתחת לפני השטח של קליפת המוח יכולה להיות מושגת באמצעות שני פוטונים מיקרוסקופיית לייזר. חלון זה הוא גם מתאים ללמוד זרימת הדם במוח ותפקוד הסלולר ההכנות הן הרדים ו ער. זה עוד יותר מציעה אופportunity לתמרן פעילות התא באמצעות optogenetics או לשבש את זרימת הדם בכלי ממוקדות על ידי הקרנה של מחזורי פוטוסנסיטייזרים.
Protocol
1. הכנות לקראת ניתוח אני נקו את כלי הניתוח על ידי sonicating בתערובת של חלב Maxizyme וכירורגי של שואב קולי. החיטוי כלי ניתוח לפני כל ניסוי. ודא שכל ריאגנטים הדרושים מתכלים זמינים. רשימה של ריאגנט…
Discussion
שני פוטונים הדמיה דרך החלון בנמלי הים דורש שידור דרך העצם דליל ואת דורה, אשר פוחתת אור לייזר ומוסיף סטיות אופטיות בעומקים גדולים יותר 8. עם זאת, למרות החיסרון הזה, במעמקי הדמיה עד 250 מיקרומטר מתחת לפני השטח pial ניתן להשיג עם עירור 900 ננומטר. בעומק הדמיה גדולים יותר ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקני (פוסט דוקטורט מלגה כדי AYS) לבין המכון הלאומי לבריאות בארה"ב (MH085499, EB003832, ו OD006831 אל DK). אנו מודים בית פרידמן פבלו Blinder על הערות על כתב היד.
Materials
| Agent | Route of delivery | Dose for mouse | Duration | Notes | Source | Ref Ref |
| Pentobarbital (Nembutal) | IP | 90 μg/g | 15-60 min | Narrow safety margin. Work up to proper dose of anesthesia slowly. Supplement 10 % of induction dose as required. | 036093; Butler Schein | 7 |
| Ketamine (Ketaset) mixed with Xylazine (Anased) | IP | 60 μg/g (K)
10 μg/g (X) (mix in same syringe) |
20-30 min | Xylazine is co-injected as a muscle relaxant and analgesic. Supplement only Ketamine at 50% of induction dose as required. | (K) 010177, (X) 033198; Butler Schein | 7 |
| Isoflurane (Isothesia) | Inhalation | 4% mean alveolar concentration (MAC) for induction; 1-2% MAC for maintenance | 4-6 h. | Provided in mixture of 70% oxygen and 30% nitrous oxide. Prolonged anesthesia leads to slow recovery. | 029403; Butler Schein | 26 |
Table 1. Suggested anesthetic agents for survival studies.
| ITEM | COMPANY | CATALOG # / MODEL |
| Betadine | Butler Schein | 6906950 |
| Buprenorphine (Buprenex) | Butler Schein | 031919 |
| Fluorescein isothiocyanate dextran, 2 MDa molecular weight | Sigma | FD2000S |
| Isopropyl alcohol | Fisher | AC42383-0010 |
| Lactated Ringer’s Solution | Butler Schein | 009846; |
| Lidocaine solution, 2 % (v/v) | Butler Schein | 002468 |
| Saline | Butler Schein | 009861 |
| Surgical Milk | Butler Schein | 014325 |
| Texas Red dextran, 70 kDa molecular weight | Invitrogen | D1864 |
| Maxizyme | Butler Schein | 035646 |
| DISPOSABLES | ||
| Carbide burrs, 1/2 mm tip size | Fine Science Tools | 19007-05 |
| Cottoned tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-100 |
| Cover Glass, no. 0 thickness | Thomas Scientific | 6661B40 |
| Cyanoacrylate glue | ND Industries | 31428 H04308 |
| Gas duster | Newegg | N82E16848043429 |
| Grip cement powder | Dentsply | 675571 |
| Grip cement solvent | Dentsply | 675572 |
| Insulin syringe, 0.3 mL volume with 29.5 gauge needle | Butler Schein | 018384 |
| Nut and bolt to secure the head | Digikey | Nut, H723-ND; bolt, R2-56X1/4-ND |
| Opthalmic ointment | Butler Schein | 039886 |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | 12-460-448 |
| Screws, self-tapping #000 | J.I. Morris Company | FF000CE125 |
| Silicone aquarium sealant | Perfecto Manufacturing | 31001 |
| Tin oxide powder | Mama’s Minerals | EQT-TINOX |
| EQUIPMENT | ||
| Glass scribe | Fisher Scientific | 08-675 |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | OPMI-1 FC |
| Electric powered drill | Foredom or Osada | K.1020 (Foredom) or EXL-M40 (Osada) |
| Electrical razor | Wahl | Series 8900 |
| Forceps, Dumont no. 55 | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Feedback regulated heat pad | FHC | 40-90-8 (rectal thermistor, 40-90-5D-02; heat pad, 40-90-2-07) |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | IsoTec4 |
| Pulse oximeter | Starr Life Sciences | MouseOx |
| Screwdriver, miniature | Garret Wade | 26B09.01 |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 (with mouse anesthesia mask and non-rupture ear bars) |
| Surgical scissors, blunt end | Fine Science Tools | 14078-10 |
| Ultrasonic cleaner | Fisher Scientific | 15-335-30 |
Table 2. List of specific reagents, disposables and equipment.
References
- Cetin, A. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1, 3166-3173 (2006).
- Kleinfeld, D., Delaney, K. R. Distributed representation of vibrissa movement in the upper layers of somatosensory cortex revealed with voltage sensitive dyes. Journal of Comparative Neurology. 375, 89-108 (1996).
- Driscoll, J. D., Yuste, R. Quantitative two-photon imaging of blood flow in cortex. Imaging in Neuroscience and Development. , 927-937 (2011).
- Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extends arteriole capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 108, 8473-8473 (2011).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window. J. Vis. Exp. (12), e678-e678 (2008).
- Zhang, S. Rapid reversible changes in dendritic spine structure in vivo gated by the degree of ischemia. Journal of Neuroscience. 25, 5333-5338 (2005).
- Takano, T. Astrocyte-mediated control of cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 9, 260-267 (2006).
- Drew, P. J. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7, 981-984 (2010).
- Marker, D. F. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. Journal of Visualized Experiments. (43), e2059-e2059 (2010).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Martin, C. Investigating neural-hemodynamic coupling and the hemodynamic response function in the awake rat. Neuroimage. 32, 33-48 (2006).
- Shih, A. Y. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2011).
- Kobat, D. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Optics Express. 17, 13354-13364 (2009).
- Holtmaat, A. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4, 1128-1144 (2009).
- Xu, H. T. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10, 549-551 (2007).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Davalos, D. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature Neuroscience. 8, 752-758 (2005).
- Ascenzi, A., Fabry, C. Technique for dissection and measurement of refractive index of osteons. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 6, 139-142 (1959).
- Stosiek, C. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
- Grinvald, A. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals. Nature. 324, 361-364 (1986).
- Dunn, A. K. Dynamic imaging of cerebral blood flow using laser speckle. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21, 195-201 (2001).
- Villringer, A. Capillary perfusion of the rat brain cortex: An in vivo confocal microscopy study. Circulation Research. 75, 55-62 (1994).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Srinivasan, V. J. Optical coherence tomography for the quantitative study of cerebrovascular physiology. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31, 1339-1345 (2011).
- Hu, S., Wang, L. V. Photoacoustic imaging and characterization of the microvasculature. Journal of Biomedical Optics. 15, 011101-011101 (2010).
- Flecknell, P. A. . Laboratory animal anesthesia. , (1987).
Tags
Polished And Reinforced Thinned-skull WindowLong-term ImagingMouse BrainIn Vivo ImagingCortical FunctionOptical AccessIntracranial EnvironmentPoRTS WindowOptical ClarityBone Regrowth InhibitionLight Scattering ReductionInflammation ReductionTwo-photon Laser Scanning MicroscopyCerebral Blood FlowCellular FunctionAnesthetized PreparationsAwake PreparationsOptogeneticsBlood Flow Disruption
Citer Cet Article
Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (61), e3742, doi:10.3791/3742 (2012).