Tillväxt av Mycobacterium tuberculosis Biofilmer
Summary
Mycobacterium tuberculosis läkemedelsformer toleranta biofilmer när de odlas i vissa villkor. Här beskriver vi metoder för odling M. tuberkulos biofilmer och bestämmer frekvensen av narkotika toleranta persisters. Dessa protokoll kommer att vara användbar för fortsatta studier i mekanismerna av läkemedel tolerans i M. tuberkulos.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis, den etiologiska orsaken till människans tuberkulos, har en extraordinär förmåga att överleva mot miljöpåfrestningar inklusive antibiotika. Även stresstolerans av M. tuberkulos är en av de troliga bidragsgivarna till den 6-månader långa kemoterapi av tuberkulos 1, de molekylära mekanismerna bakom denna egenskap fenotyp av den sjukdomsalstrande fortfarande oklara. Många mikrobiella arter har utvecklats för att överleva i stressiga miljöer genom självorganiserande i mycket organiserade fäst yta och matris inkapslade strukturer som kallas biofilm 2-4. Tillväxt i samhällen förefaller vara en föredragen överlevnadsstrategi av mikrober, som kan uppnås genom genetiska komponenter som reglerar ytvidhäftning, intercellulära kommunikationen, och syntes av extracellulära polymera substanser (EPS) 5,6. Toleransen av miljöbetingad stress är sannolikt underlättas av EPS, och kanske av physiologiska anpassning av individuella baciller till heterogena mikromiljöer inom komplex arkitektur av biofilmer 7.
I en serie nya dokument vi etablerat att M. tuberkulos och Mycobacterium smegmatis har en stark benägenhet att växa i organiserade flercelliga strukturer, som kallas biofilmer, vilket kan tolerera mer än 50 gånger de minimala inhibitoriska koncentrationen av anti-tuberkulos läkemedel isoniazid och rifampicin 8-10. M. tuberkulos, men fascinerande kräver särskilda förhållanden för att bilda mogna biofilm, särskilt 9:1-förhållande i headspace: media samt begränsat utbyte av luft med atmosfären 9. Kraven specialiserade miljöförhållanden kan eventuellt kopplas till det faktum att M. Tuberkulos är en obligat mänskligt patogen och har därmed anpassats till vävnad miljöer. I denna publikation visar vi metoder för odling M. tuberkulosbiofilmer i en flaska och en 12-brunnars platta format, vilket är bekvämt för bakteriologiska samt genetiska studier. Vi har beskrivits i protokollet för en försvagad stam av M. tuberkulos, mc 2 7000, med strykning i de två loci, panCD och RD1, som är avgörande för in vivo tillväxt av patogenen 9. Denna stam kan användas säkert i en BSL-2 inneslutning för att förstå grundläggande biologi tuberkulos patogenen därmed undvika kravet på en dyr BSL-3 anläggning. Metoden kan förlängas med lämplig modifiering i media, att växa biofilm av andra odlingsbara mykobakteriella arter.
Sammantaget kommer en enhetlig protokoll för odling mykobakteriella biofilmer hjälpa utredarna intresserade av att studera de grundläggande elastiska egenskaper mykobakterier. Dessutom kommer en klar och koncis metoden för växande mykobakteriella biofilmer bidrar också den kliniska och farmaceutiska investigators för att testa effektiviteten av ett potentiellt läkemedel.
Protocol
Discussion
Tuberkulos (tbc), orsakad av infektion av Mycobacterium tuberculosis, är fortfarande ett stort hot mot den globala folkhälsan. Nästan en tredjedel av världens befolkning beräknas vara asymptotiskt smittas av patogenen, cirka 9 miljoner nya fall dyker upp i kliniken varje år med symtom på aktiv tuberkulos och ungefär 1,7 miljoner dör av infektionen varje år 11. Den stora bördan av sjukdomen i första hand bidragit med brist på vaccin och en mycket komplicerad kemoterapi som innebär en mul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet har utförts med ekonomiskt stöd från National Institute of Health och American Lung Association.
Materials
| Equipment and supplies | SUPPLIER | CATALOG NUMBER |
| Incubator | VWR | Model # 1923/25 |
| Polystyrene culture bottles | Fisher Scientific | 03-374-300 |
| 12-well tissue culture plate | VWR | 62406-165 |
| 50-mL conical tubes | VWR | 89039-660 |
| Rocker | Thermo Scientific | 57019-662 |
| Chromatographic refrigerator | VWR | 55702-520 |
| petri dish | VWR | 25384-342 |
| REAGENT | SUPPLIER | CATALOG NUMBER |
| KH2PO4 (monobasic) | EMD | PX1565-1 |
| MgSO4 | Fisher | M65-500 |
| L-asparagine | Sigma | A4284-100G |
| citric acid | Sigma | C1857-100G |
| ferric ammonium citrate | Sigma | F5879-100G |
| glycerol | EMD | GX0185-5 |
| NaOH | Sigma | S8045-500G |
| ZnSO4 | Sigma | Z4750-500G |
| D-pantothenic acid | Sigma | P2250-25G |
| Difco Middlebrook 7H9 Broth | Becton Dickinson | 271310 |
| Middlebrook OADC Enrichment | BBL | 212351 |
| Tween-80 | Fisher | T164-500 |
| 250mL storage bottle | Corning | 430281 |
| 12 well plates | Falcon (BD) | 353043 |
| rifampicin | Sigma | R3501-1G |
| methanol | J.T. Baker | 9070-05 |
| 10mlLsyringe | Becton Dickinson | 301604 |
| 1-200μL pipet tips | VWR | 89079-458 |
| parafilm M | VWR | PM-996 |
| 15mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188-285 |
| Difco Mycobacteria 7H11 Agar | Becton Dickinson | 283810 |
| NaCl | Fisher | BP358-1 |
| KCl | Sigma | P9333-500G |
| Na2HPO4 (dibasic) | Sigma | S0876-500G |
References
- Saltini, C. Chemotherapy and diagnosis of tuberculosis. Respir. Med. 100, 2085-2097 (2006).
- Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens. Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
- Henke, J. M., Bassler, B. L. Bacterial social engagements. Trends Cell Biol. 14, 648-656 (2004).
- Kolter, R., Losick, R. One for all and all for one. Science. 280, 226-227 (1998).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Ojha, A. GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria. Cell. 123, 861-873 (2005).
- Ojha, A. K. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Mol. Microbiol. 69, 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. J. Biol. Chem. 285, 17380-17389 (2010).
- Dye, C., Lonnroth, K., Jaramillo, E., Williams, B. G., Raviglione, M. Trends in tuberculosis incidence and their determinants in 134 countries. Bull World Health Organ. 87, 683-691 (2009).
- Jindani, A., Dore, C. J., Mitchison, D. A. Bactericidal and sterilizing activities of antituberculosis drugs during the first 14 days. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 1348-1354 (2003).
- Carter, G., Wu, M., Drummond, D. C., Bermudez, L. E. Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium. J. Med. Microbiol. 52, 747-752 (2003).
- Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. Biofilm formation by the rapidly growing mycobacterial species Mycobacterium fortuitum. FEMS Microbiol. Lett. 168, 77-84 (1998).
- Alibaud, L. Temperature-dependent regulation of mycolic acid cyclopropanation in saprophytic mycobacteria: role of the Mycobacterium smegmatis 1351 gene (MSMEG_1351) in CIS-cyclopropanation of alpha-mycolates. J. Biol. Chem. 285, 21698-21707 (2010).
