قياس من الانجذاب الكيميائي الخلوي مع ECIS / سيارات الأجرة
Summary
نظام ECIS / سيارات الأجرة هو الآلي، في الوقت الحقيقي فحص الكيميائي الذي يقيس الخلوية. في هذا الاختبار، وخلايا تتحرك تحت طبقة من الاغاروز للوصول إلى القطب الهدف. ويتم قياس حركة الخليوي عن ظهور المقاومة إلى 0 ميلان الحالي.
Abstract
حركة الخلوية في استجابة للمؤثرات الخارجية أمر أساسي لكثير من العمليات الخلوية بما في ذلك التئام الجروح، والالتهابات، واستجابة للعدوى. وهناك طريقة شائعة لقياس الكيميائي هو فحص غرفة بويدن، حيث يتم فصل الخلايا وجاذب كيميائي بواسطة غشاء مسامي. كما تهاجر الخلايا من خلال غشاء نحو جاذب كيميائي، كانوا متمسكين السفلي من الغشاء، أو الوقوع في وسائل الإعلام الأساسية، وملطخة في وقت لاحق وعدها بصريا 1. في هذه الطريقة، تتعرض الخلايا لالانحدار 1 جاذب كيميائي حاد وعابر، والتي يعتقد أن يكون تمثيل الفقراء من التدرجات وجدت في الأنسجة 2.
آخر نظام الفحص، وكيل الاغاروز الكيميائي فحص، 3، 4 حركة الخلية عبر تدابير ركيزة صلبة في الفيلم المائية التي تشكل رقيقة تحت طبقة الاغاروز. الانحدار الذي يتطور في الاغاروز ضحلة، ويعتقد أن يكون التطبيقropriate تمثيل طبيعيا التدرجات. ويمكن تقييم الكيميائي عن طريق التصوير المجهري للالمسافة المقطوعة. وعادة ما يتم تكوين كلا من الدائرة بويدن الفحص وفحص تحت الاغاروز كما المقايسات نقطة النهاية.
الآلي ECIS / سيارات الأجرة نظام يجمع بين نهج وكيل الاغاروز مع الكهربائية الاستشعار عن الممانعة الخلوي الركيزة (ECIS) 5 و 6. في هذا الاختبار، وتقع الأقطاب هدف في كل من 8 غرف. وقال كبير لمكافحة قطب كهربائي يعمل من خلال كل دائرة من الدوائر 8 (الشكل 2). يتم تعبئة كل غرفة مع الاغاروز واثنين من الآبار الصغيرة هي قطع في الاغاروز على جانبي القطب الهدف. واحد جيد مليء اختبار سكان الخلية، في حين أن الآخر يحمل مصادر جاذب كيميائي نشرها (الشكل 3). ويمكن استخدام الحالي مرت من خلال نظام لتحديد التغير في المقاومة التي تحدث باسم خلايا تمر فوق القطب الهدف. electrod الخلايا على الهدفه زيادة المقاومة للنظام 6. وبالإضافة إلى ذلك، والتقلبات السريعة في المقاومة تمثل تغيرات في تفاعلات الخلايا التي تحتوي على سطح القطب وتدل على التغيرات الجارية شكل الخلوية. لا يمكن للنظام ECIS / سيارات الأجرة قياس حركة السكان الخلية في الوقت الحقيقي على مدى فترات طويلة من الزمن، ولكن أيضا حساسة بما يكفي للكشف عن وصول خلية واحدة في القطب الهدف.
ومن المعروف Dictyostelium discoidium للهجرة في وجود حمض الفوليك التدرج 7 و 8، ويمكن ردها الكيميائي تقاس بدقة بواسطة ECIS / سيارات الأجرة 9. الكيميائي الكريات البيض، واستجابة لSDF1α والخصوم الكيميائي كما تم قياسه مع ECIS / سيارات الأجرة 10 و 11. ويرد مثال على استجابة الكريات البيض إلى SDF1α في الشكل 1.
Protocol
Discussion
خصائص رواية للفحص ECIS / سيارات الأجرة وتشمل قدرتها على أتمتة عملية جمع البيانات في الوقت الحقيقي وخلايا الاستجابة للجاذب كيميائي. في حين أن تطبيق معظم شائعا لهذه التكنولوجيا هو قياس الاستجابات الخلوية لالتدرجات الكيميائي الفردية، أو إلى التدرجات تتكون من خليط من ناه…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (ES07408 وEB00208).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog number | Comments |
| ECIS Zθ | Applied Biophysics | http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php | |
| ECIS Electrode Array | Applied Biophysics | 8W Chemotaxis | http://www.biophysics.com/cultureware.php |
| Seakem GTG agarose | BioWhittaker Molecular Applications | 50070 | |
| RPMI1640 | Cellgro | 10-040 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH300703 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | Penicillin 5,000 IU/ml; Streptomycin 5 mg/ml |
| HEPES Buffer | MP Biomedicals | 1688449 | 1M solution, cell culture grade |
| 14 Gauge stainless steel Cannula (2) 4 inch | General Laboratory Supply | 5-8365-1 | Blunt point |
References
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays. Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).
- Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay. J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).
- Keese, C. G. I. A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).
- Laevsky, G., Knecht, D. A. Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments. J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).
- Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion. 11, 5-6 (1990).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).
- Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis. J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).
- Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury. J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).
- Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers. J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).
- Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity. Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).
- Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation. J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).
- Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).
