Meting van Cellulaire Chemotaxis met ECIS / Taxis
Summary
De ECIS / Taxi-systeem is een geautomatiseerde, real-time test die cellulaire chemotaxis meet. In deze assay cellen bewegen onder een laag van agarose om tot een doel elektrode. Cellulaire beweging wordt gemeten door het optreden van resistentie tegen wisselstroom 0.
Abstract
Cellulaire beweging in reactie op externe prikkels is fundamenteel voor een groot aantal cellulaire processen zoals wondgenezing, ontsteking en de reactie op infectie. Een gebruikelijke methode om chemotaxis meten is Boyden kamer assay, waarin cellen en chemoaantrekkende worden gescheiden door een poreus membraan. Zoals cellen migreren door het membraan naar de chemoattractant, zij zich aan de onderzijde van het membraan of vallen in de onderliggende media en vervolgens gekleurd en visueel geteld 1. In deze werkwijze worden cellen blootgesteld aan een steile gradiënt voorbijgaande chemoaantrekkende, waarvan men denkt dat een slechte weergave van gradiënten in weefsels 2.
Een bepalingssysteem, de onder-agarose chemotaxis assay, 3, 4 maatregelen cel beweging over een vast substraat in een dunne film vormt waterige onder agarose laag. De gradiënt die zich ontwikkelt in de agarose is ondiep en wordt gedacht om een app te zijnropriate vertegenwoordiging van natuurlijk voorkomende gradiënten. Chemotaxis kan worden geëvalueerd door microscopische beeldvorming van de afgelegde afstand. Zowel de Boyden kamer test en de onder-agaroseanalyse worden meestal geconfigureerd als eindpunt assays.
De geautomatiseerde ECIS / Taxis systeem combineert de onder-agarose aanpak met elektrische cel-substraat Impedantie Sensing (ECIS) 5, 6. In deze assay worden doel elektroden in elk van 8 kamers. Een grote tegenelektrode loopt door elk van de 8 kamers (figuur 2). Elke kamer is gevuld met agarose en twee putten de snede in de agarose aan weerszijden van het doel elektrode. Een goed gevuld met de test celpopulatie, terwijl de andere houder bronnen diffunderen chemoattractant (figuur 3). Stroom door het systeem kan worden gebruikt om de verandering van de weerstand die optreedt als cellen passeren het doel elektrode bepalen. Cellen op het doel electrode de weerstand van het systeem 6. Bovendien snelle fluctuaties in de weerstand die de veranderingen in de interacties van cellen met het elektrodemateriaal en wijzen lopende cellulaire vormveranderingen. De ECIS / Taxi-systeem kan meten beweging van de cel bevolking in real-time over langere tijd, maar is ook gevoelig genoeg om de komst van een enkele cel op het doel elektrode op te sporen.
Dictyostelium discoidium bekend migreren in aanwezigheid van een foliumzuur gradiënt 7, 8 en chemotactische reactie nauwkeurig kan worden gemeten door ECIS / Taxis 9. Leukocyte chemotaxis is in reactie op SDF1α en chemotaxis antagonisten ook gemeten ECIS / Taxis 10, 11. Een voorbeeld van leukocyten reactie SDF1α is weergegeven in figuur 1.
Protocol
Discussion
Nieuwe kenmerken van de ECIS / Taxis test zijn onder meer de mogelijkheid om het verzamelen van real-time data te automatiseren als cellen reageren op chemoattractant. Hoewel de meest voorkomende toepassing van deze technologie is het cellulaire reacties te meten aan de individuele chemotactische hellingen, of om hellingen bestaan uit mengsels van chemotaxis agonisten en antagonisten van de ECIS / Taxi's benadering is ook vatbaar is voor variaties op deze configuraties die kunnen heel nuttig zijn bij de beoord…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (ES07408 en EB00208).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog number | Comments |
| ECIS Zθ | Applied Biophysics | http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php | |
| ECIS Electrode Array | Applied Biophysics | 8W Chemotaxis | http://www.biophysics.com/cultureware.php |
| Seakem GTG agarose | BioWhittaker Molecular Applications | 50070 | |
| RPMI1640 | Cellgro | 10-040 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH300703 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | Penicillin 5,000 IU/ml; Streptomycin 5 mg/ml |
| HEPES Buffer | MP Biomedicals | 1688449 | 1M solution, cell culture grade |
| 14 Gauge stainless steel Cannula (2) 4 inch | General Laboratory Supply | 5-8365-1 | Blunt point |
References
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays. Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).
- Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay. J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).
- Keese, C. G. I. A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).
- Laevsky, G., Knecht, D. A. Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments. J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).
- Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion. 11, 5-6 (1990).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).
- Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis. J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).
- Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury. J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).
- Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers. J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).
- Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity. Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).
- Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation. J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).
- Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).
