Mätning av Cellular Kemotaxis med ECIS / Taxi
Summary
Den ECIS / Taxi-systemet är en automatiserad, real-time-analys som mäter cellulära kemotaxi. I denna analys celler röra sig under ett skikt av agaros att komma fram till en mål-elektrod. Cellulär rörelse mäts genom insättande av resistens mot växelströmmen 0.
Abstract
Cellulär rörelse som svar på externa stimuli är grundläggande för många cellulära processer, inklusive sårläkning, inflammation och svaret på infektion. En vanlig metod för att mäta kemotaxi är Boydenkammare-analys i vilket celler och kemoattraherande är åtskilda av ett poröst membran. Som celler vandrar genom membranet mot kemoattraherande, följa de till undersidan av membranet, eller falla in i de underliggande media och därefter färgas och visuellt räknas 1. I denna metod exponeras celler för en brant och övergående kemoattraherande gradient, som tros vara en dålig bild av gradienter som finns i vävnader 2.
En annan analyssystem, under-agaros kemotaxianalys, 3, 4 åtgärder cellrörelse över ett fast substrat i en tunn vattenhaltig film som bildas under agaros skiktet. Den gradient som utvecklas i agaros är grund och tros vara en apphållbarhet enligt representation av naturligt förekommande gradienter. Kemotaxi kan utvärderas genom mikroskopisk avbildning av den tillryggalagda sträckan. Både Boydenkammare-analysen och den under-agaros-analys vanligen utformade som slutpunkter analyser.
Den automatiserade ECIS / Taxi-systemet kombinerar under-agaros strategi med Electric Cell-substrat Impedans Sensing (ECIS) 5, 6. I denna analys är mål-elektroder placerade i var och en av 8 kammare. En stor motelektroden löper genom var och en av de 8 kamrarna (figur 2). Varje kammare är fylld med agaros och två små brunnarna är sänkningen av agaros på vardera sidan av målet elektroden. En brunn fylls med testet cellpopulationen, medan den andra håller källor sprida kemoattraherande (Figur 3). Ström som passerar genom systemet kan användas för att bestämma förändringen i motstånd som uppträder när cellerna passerar över det valda elektroden. Celler på målet electrode öka motståndet hos systemet 6. Dessutom snabba variationer i motståndet representerar förändringar i interaktionerna mellan cellerna med elektrodytan och indikerar pågående cellulära formförändringar. Den ECIS / Taxibilar systemet kan mäta rörelse hos cellpopulationen i realtid över utsträckta tidsperioder, men är också tillräckligt känsliga för att detektera ankomsten av en enda cell på målet elektroden.
Dictyostelium discoidium är känt att migrera i närvaro av en folat-gradient 7, 8 och dess kemotaktiska svaret kan mätas noggrant som ECIS / Taxibilar 9. Leukocytkemotaxi, har som svar på SDF1α och kemotaxi antagonister också mätts med ECIS / Taxibilar 10, 11. Ett exempel på leukocyt svar på SDF1α visas i figur 1.
Protocol
Discussion
Nya egenskaper ECIS / Taxis analysen innefattar dess förmåga att automatisera insamling av realtidsdata som celler svarar på chemoattractant. Medan den mest vanliga tillämpningen av denna teknik är att mäta cellulära svar på enskilda kemotaktiska gradienter, eller gradienter består av blandningar av kemotaxi agonister och antagonister är ECIS / Taxis strategi också mottaglig för variationer av dessa konfigurationer som kan vara till stor hjälp i Bedömningen av cellulär respons. Det finns goda bevis för a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health (ES07408 och EB00208).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog number | Comments |
| ECIS Zθ | Applied Biophysics | http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php | |
| ECIS Electrode Array | Applied Biophysics | 8W Chemotaxis | http://www.biophysics.com/cultureware.php |
| Seakem GTG agarose | BioWhittaker Molecular Applications | 50070 | |
| RPMI1640 | Cellgro | 10-040 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH300703 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | Penicillin 5,000 IU/ml; Streptomycin 5 mg/ml |
| HEPES Buffer | MP Biomedicals | 1688449 | 1M solution, cell culture grade |
| 14 Gauge stainless steel Cannula (2) 4 inch | General Laboratory Supply | 5-8365-1 | Blunt point |
References
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays. Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).
- Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay. J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).
- Keese, C. G. I. A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).
- Laevsky, G., Knecht, D. A. Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments. J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).
- Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion. 11, 5-6 (1990).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).
- Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis. J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).
- Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury. J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).
- Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers. J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).
- Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity. Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).
- Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation. J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).
- Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).
