Microscopie multiphotonique de cerveau de souris Effacé Exprimant YFP
Summary
Microscopie multiphotonique des organes de souris entiers est possible par compensation optiquement l'organe avant l'imagerie, mais pas tous les protocoles de préserver le signal de fluorescence des protéines fluorescentes. En utilisant une méthode de compensation optique avec de l'éthanol à base de déshydratation et d'alcool benzylique: benzoate de benzyle compensation, nous montrons des images haute résolution multiphotoniques de cerveau de souris exprimant toute la YFP.
Abstract
Microscopie multiphotonique de fluorescence intrinsèque génération d'harmoniques et seconde (SHG) d'organes de souris entiers est rendue possible par l'organe optique de compensation avant l'imagerie. 1,2 Cependant, pour des organes qui contiennent des protéines fluorescentes comme la GFP et YFP, les protocoles de compensation optique utilisant du méthanol déshydratation et clair à l'alcool benzylique: benzoate de benzyle (BABB), tandis que la lumière non protégée de 3 ne conservent pas le signal fluorescent. Le protocole présenté ici est une nouvelle façon dans laquelle effectuer la compensation organe entier optique sur le cerveau de la souris tout en préservant le signal de fluorescence de la YFP exprimé dans les neurones. Modification du protocole de compensation optique telle que l'organe est déshydraté par une série d'éthanol à a été trouvé pour réduire les dommages causés aux protéines fluorescentes et de préserver leur signal fluorescent pour l'imagerie multiphotonique. 4 Utilisation d'une méthode optimisée de compensation optique avec de l'éthanol à base de déshydratation et compensation par BABBtandis abri de la lumière, nous montrons des images haute résolution multiphotoniques de jaune protéines (YFP) expression fluorescente dans les neurones d'un cerveau de souris plus de 2 mm sous la surface du tissu.
Protocol
Discussion
Bien standards colorants organiques sont compatibles avec une gamme de solvants organiques, et donc ne posent pas de problème particulier pour la compensation des protocoles, des protéines fluorescentes sont souvent moins tolérants des changements dans le solvant. 4 L'objectif de ce travail était de surmonter une limitation sérieuse de précédentes protocoles de compensation optique où la fluorescence de XFP a été perdue ou gravement dégradées. Les images qui sont présentées ici montrent que …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Jacob Solis pour son aide dans le montage vidéo.
Ce travail a été financé en partie par une bourse de carrière NSF DBI-0953902 à MJ Levene.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Inc. | D8537 | 500 ml, pH 7.2 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde |
| Ethyl alcohol | American Bioanalytical | AB00515-00500 | 500 ml, 200 proof |
| Ethyl alcohol | Pharmco Products, Inc. | 111000190 | 1 gal., 190 proof |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich, Inc. | 402834 | 500 ml, 99+% |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich, Inc. | B6630-IL | 500 ml, ≥ 99% |
| 5X/0.5 NA objective | Nikon | AZ Plan Flour 5X | 15 WD |
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