Microscopia Multiphoton di cervello di topo Cancellato Esprimere YFP

Summary

Microscopio multifotone di organi topo intero è possibile otticamente deselezionando l'organo prima di imaging, ma non tutti i protocolli di preservare il segnale fluorescente di proteine ​​fluorescenti. L'utilizzo di un metodo ottico di compensazione con etanolo a base di disidratazione e alcol benzilico: benzil benzoato di compensazione, mostriamo immagini ad alta risoluzione multiphoton di cervello di topo che esprime tutta la YFP.

Abstract

Microscopio multifotone di fluorescenza intrinseca generazione e seconda armonica (SHG) di organi topo intero è reso possibile dal otticamente deselezionando l'organo prima di imaging. ^1,2 Tuttavia, per gli organi che contengono proteine ​​fluorescenti come la GFP e YFP, protocolli di compensazione ottica che utilizzano metanolo disidratazione e chiaro con alcool benzilico: benzil benzoato (BABB), mentre non protetto dalla luce ³ non preservare il segnale fluorescente. Il protocollo qui presentato è un nuovo modo in cui effettuare la compensazione intero organo ottico sul cervello di topo preservando il segnale di fluorescenza di YFP espresso nei neuroni. La modifica del protocollo ottico di compensazione in modo tale che l'organo è disidratato utilizzando una serie graduata di etanolo è stato trovato per ridurre i danni alle proteine ​​fluorescenti e preservare il loro segnale fluorescente per l'imaging multifotone. ⁴ Utilizzo di un metodo ottimizzato dei sistemi di compensazione ottica con etanolo a base di disidratazione e compensazione da BABBmentre al riparo dalla luce, si mostrano immagini ad alta risoluzione multiphoton di giallo proteina fluorescente (YFP) espressione nei neuroni di un cervello di topo superiore a 2 mm sotto la superficie del tessuto.

Protocol

1. Animal perfusione 5 e tutto Clearing cervello di topo L'intera lunghezza della procedura può variare a seconda della lunghezza del tempo utilizzato per fase di disidratazione, ma in totale l'intero processo può essere condotto in due giorni. Pesare topi YFP quindi profondamente anestetizzare con una iniezione intraperitoneale di ketamina / xilazina (100 mg / kg: 10 mg / kg). Conferma un piano chirurgico di anestesia profonda prima di procedere alla chirurgia. Contro…

Discussion

Mentre standard di coloranti organici sono compatibili con una gamma di solventi organici, e quindi non pongono una sfida particolare per la compensazione protocolli, proteine ​​fluorescenti sono spesso meno tollerante di cambiamenti nel solvente. ⁴ Lo scopo del presente lavoro era di superare una grave limitazione precedenti protocolli di compensazione ottica in cui è stato perso di fluorescenza di XFP o gravemente degradato. Le immagini che vengono qui presentati dimostrano che la fluorescenza di YFP ?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich, Inc.	D8537	500 ml, pH 7.2
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde
Ethyl alcohol	American Bioanalytical	AB00515-00500	500 ml, 200 proof
Ethyl alcohol	Pharmco Products, Inc.	111000190	1 gal., 190 proof
Benzyl alcohol	Sigma-Aldrich, Inc.	402834	500 ml, 99+%
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich, Inc.	B6630-IL	500 ml, ≥ 99%
5X/0.5 NA objective	Nikon	AZ Plan Flour 5X	15 WD