Visualisering og analyse af blodgennemstrømning og iltforbruget i Nedsat mikrocirkulation: Ansøgning til en akut hepatitis model

Summary

Et optisk system blev udviklet for at visualisere hepatisk mikrocirkulation med FITC-mærkede erythrocytter og at måle partialtrykket af oxygen i mikrokarrene med laser-assisteret phosphorimetry. Denne fremgangsmåde kan anvendes til at undersøge fysiologiske og patologiske mekanismer ved at analysere mikrovaskulær struktur diameter, blod strømningshastighed og oxygenspænding.

Abstract

Der er et betydeligt misforhold mellem ilt udbud og efterspørgsel i leveren, fordi nedsat iltforbrug er relativt høj, men omkring 70% af den hepatiske blodforsyningen er dårligt iltet portal vene blod stammer fra mave-tarmkanalen og milt. Oxygen leveres til hepatocytter ved blodet flyder fra en terminal gren af ​​portalen vene til en central vener via sinusoider, og det gør en ilt gradient i hepatiske lobules. Den ilt gradient er en vigtig fysisk parameter, som involverer ekspression af enzymer opstrøms og nedstrøms i lever mikrocirkulationen, men manglen på teknikker til måling af ilt forbrug i leverens mikrocirkulation har forsinket opklaringen af ​​mekanismerne for ilt metabolisme i leveren. Vi har derfor anvendt FITC-mærkede erythrocytter at visualisere den hepatiske mikrocirkulationen og anvendte laser-assisteret phosphorimetry at måle partialtrykket af oxygen i mikrokar der. NoncontaCT og kontinuerlig optisk måling kan kvantificere blodstrømningshastigheder og kardiametre og oxygen gradienter forbindelse oxygenforbrug i leveren. I en akut hepatitis model, vi har gjort ved at administrere acetaminophen til mus vi observeret øget ilt tryk i både portal og centrale vener, men en nedsat ilt gradient i sinusoider, hvilket indikerer, at hepatocyt nekrose i pericentral zone kunne flytte ilt trykket op og påvirke enzym udtryk i periportal zone. Som konklusion, kan vores optiske metoder til måling af hepatiske hæmodynamik og iltforbrug afsløre mekanismer, relateret til leversygdomme.

Protocol

1. Mærkning Erythrocytter med fluorescein-isothiocyanat Isomer I (FITC)

Alle de eksperimentelle protokoller, vi brugte, blev godkendt af Animal Care udvalget Keio University School of Medicine.

1. Bedøve en donormus, og efter at en celiotomy indsnit trække helblod fra inferior vena cava med en 1 ml sprøjte indeholdende lille mængde heparin. Mus blev straks aflivet ved natriumpentobarbital injektion (100 mg / kg ip).
2. Vaskes helblod to gange med PBS (pH 7,4) ved centrifugering i 5 minutter ved 400 g i en svingende-rotor.
3. Opløs 10 mg FITC i 5 ml 100 mM _{Na2HPO 4} og filtreres den med en membran med 0,22 um porer.
4. I et reagensglas blandes 1 ml FITC-opløsning med 0,15 ml 3 mM glucose, 0,25 ml 180 mM NaH _{2PO 4,} og 1,5 ml 100 mM _{Na2HPO 4.} Tilsættes 0,2 ml af RBC pellet, og tryk på røret for at blande.
5. Holder røret i 2 timer ved 4 ° C og derefter vaskes de farvede RBC'erne i PBS to gange.
6. Sætte en lille mængde af RBC-suspension på et objektglas græs og se, om RBC'erne ser sunde (dvs., at deres form og størrelse er normalt), og at fluorescensintensiteten er tilstrækkelig.
7. Suspendere 0,1 ml af RBC i 0,9 ml PBS ved pH 7,4, og holde suspensionen ved 4 ° C indtil injektion.

2. Fremstilling af oxygen-følsomme farvestof

1. Opløs 500 mg BSA i 10 ml PBS ved pH 7,4.
2. Tilsættes 30 mg Pd (II)-meso-tetra (4-carboxyphenyl) porphin (Pd-TCPP) til BSA-opløsningen og omrørtes natten over.
3. (Valgfrit) ekstraheres BSA-bundne Pd-TCPP ved hjælp af tyngdekraften-flow-chromatografi eller en centrifugesøjle at adskille den fra frit Pd-TCPP.
4. Centrifugeres opløsningen for at fjerne uopløst Pd-TCPP og filtrere supernatanten med et membranfilter med 0,22 um porer. </ Li>
5. Store 1 ml-portioner i rør ved -20 ° C. Undgå gentagne fryse-tø-cykler.

3. Animal Forberedelse

1. Til mikroskopisk observation af mikrokredsløbet fremstille en plastplade med et hul 20 mm i diameter, og tape en 30-mm-kvadrat kvadratisk dækglas over hullet.
2. Bedøver en mus, skal du fjerne pels, og prep huden. Placere et kateter i halen forgæves efter lægemiddelinjektion ved hjælp af en 30 G nål forbundet til en 10 cm polyethylen (PE 10) kateter fyldt med hepariniseret PBS.
3. Efter median incision, udvide en primær lille lap af leveren på plastplade, og placer musen i brystleje.
4. Forbered små sedler med køkken wrap (3 mm x 8 mm) og flise dem rundt i kanten af ​​den hepatiske lap til at hæmme bevægelse af leveren med åndedræt og holde det mod udtørring.
5. Overhold leverens mikrocirkulation under et mikroskop (med lys), og bekræfter, at blood flow ikke stasis i synsfeltet for mindst 15 minutter.
6. Injicer langsomt 0,2 ml af fluorescensmærkede RBC'er for blodstrømning observation eller 0,2 ml af Pd-TCPP opløsning _pO2 måling. Denne mængde af FITC-mærkede røde blodlegemer vil udgøre 1/50 af alle RBC'er i omløb i visualiseret regionen.

4. Blood Flow Visualisering

1. Excitere FITC ved bestråling det med kviksølvlampe lys, der har passeret gennem et båndpasfilter (450-490 nm) ^1.
2. Optage fluorescerende billede med et CCD-kamera.

5. pO ₂ Måling

Pd-TCPP phosphorescens er relativt svag og skal detekteres med en høj følsomhed detektor. Alle eksperimenter skal udføres i et mørkt rum.

1. De absorptionstoppe ved Pd-TCPP er ved 410 nm og 532 nm, så den anden harmoniske bølgelængde 532 nm anbefales til excitation. Denne bølgelængde kan genereres ved en Nd: YAG pulslaser ^2.
2. Før stråle fra Nd: YAG laser i den relevante port på omvendt mikroskop, og justere strålen stedet til en central position i brændplanet. Den rumlige opløsning afhænger laserpletten størrelse, som ændres ved at lede strålen gennem et lille hul.
3. At detektere phosphorescens, fastgøres langpasfilter (> 620 nm) og et fotomultiplikatorrør (PMT) til den anden port af mikroskopet. PMT bør være følsom over for røde bølgelængder, især omkring 700 nm.
4. Sample phosphorescens signal (500 point samplet ved 200 kHz), og beregne tidskonstant henfald ved at anbringe en eksponentiel funktion af henfald.
5. Til kalibrering forberede to sæt prøver af Pd-TCPP løsning med pO ₂ 150 mmHg og 0 mmHg. Tilsættes dithionit natrium 1% i volumen for at prøve at producere fravær af oxygen. Holde pH af prøverne på 7,4 og temperaturen ved 37 ° C under kalibrering.
6. Fiksere Stern-Volmer konstanten k _q og oxygen-fri luminescens henfaldstid τ ₀ i ligningen (1) ^3. I vores tilfælde med Pd-TCPP opløsninger ved 37 ° C og en pH på 7,4, er k _q 374 mmHg ^1s-1 og τ ₀ er 0,74 ms. Disse målinger parametre afhænger af udstyr (dvs. laseren, detektor, andre optiske indretninger), og signalbehandlingen metode, så kalibrering er nødvendig i hver målesystem ^4.
   τ ₀ / τ = ​​1 + k _q • τ ₀ • _pO2 (1)
7. Sæt musen på pladen på mikroskopbordet, observere det hepatiske mikrocirkulationen, og justere positionen af ​​målet mikrokardannelse til det punkt laseren stedet.

6. Hepatitis Model

1. Hurtige mus med fri adgang til vand natten over.
2. Forbered en20 mg per ml opløsning af acetaminophen (APAP) i DMSO.
3. Sprøjt det intraperitonealt på 1 ml/100 g kropsvægt (dvs. 200 mg / kg legemsvægt). Efter injektionen, kan musen gives fri adgang til mad og vand ^5.
4. 24 timer efter injektion, bedøve mus og blotlægge leveren ved at lave en median incision. Hvis hepatitis er opnået, vil nekrose i pericentral region være let synlig for det blotte øje.

7. Repræsentative resultater

Eksempel billeder af hepatisk mikrocirkulation er vist i figur 1, hvor (a) er en transmitteret lys billede og (b) er et fluorescensbillede. Individuelle FITC-mærkede erytrocytter er observeret i video-film, og portal venuler, sinusoider og centrale venuler er anerkendt af blodgennemstrømningen retninger.

Som vist i figur 2, laserpletten bestråle en central venulen gennem en x100 objektivlinse var approximbart 10 um i diameter. Intravaskulær pO ₂ i leverens mikrocirkulation blev målt i C57BL / 6 mus, og figur 3 (a) viser forholdet mellem po ₂ og fartøj diameter i portal og centrale vener. PO ₂ gradient fra portal til centrale vener indikerer, at RBC frigiver ilt effektivt, mens der passerer gennem sinusoider. Som vist i figur 3 (b), var den gennemsnitlige _pO2 59,8 mmHg i portal fartøjer, 48,2 mmHg i sinusoider og 38,9 mmHg centrale venuler.

Når vi fremstillet akut hepatitis ved injektion APAP intraperitonealt blev intravaskulær _pO2 signifikant forhøjet i hver del af den hepatiske mikrocirkulation: p <0,05 i portal vener og p <0,01 i sinusoider og centrale vener (figur 3 (c)).

Figur 1. Lav forstørrelse iMages viser nedsat mikrocirkulation med (a) transmitteret lys og (b) fluorescens.

Figur 2. Billede af laserpletten bestråle en målrettet central venulen for PO ₂ måling.

Figur 3. _PO2-gradient i hepatisk mikrocirkulation raske kontrolmus og mus med acetaminophen-induceret leverskade. (A) viser _pO2 versus kardiameter for portal venuler (PV) og centrale venuler (CV), og (b) viser oxygen gradient fra PV til CV via sinusoider (S). PO ₂ Forskellen mellem PV og CV afspejler iltforbrug hepatocytter eller andre parenchymale celler. (C) viser, at hepatitis betingelser fremkaldt af APAP administration blev _pO2 signifikant forhøjet i PV, S og CV og PO ₂gradient faldet, hvilket indikerer, at nedsat iltforbrug blev kompromitteret.

Discussion

Levering af ilt til væv er en væsentlig rolle i mikrocirkulationen, og en masse papirer beskriver sygdomme relateret til mikrokardannelse anatomi og reologi ^6. Blodgennemstrømning gennem leveren er en kombination af arterielt og venøst ​​blod. 30% af blodstrømmen til leveren, er vel-oxygeneret blod tilvejebragt fra den hepatiske arterie, og den anden 70%, fra portvenen, er dårligt iltet blod venøs udstrømning fra milten og mavetarmkanalen ^7. Leversygdomme såsom fedtlever, chok eller tumor ændring blodgennemstrømningen i den hepatiske mikrocirkulation. For at bestemme iltningen af ​​vævet, er man nødt til at måle både blodgennemstrømningen og ilt koncentration i mikrocirkulationen. Manglen på kommercielt tilgængelige midler til at foretage disse målinger i leverens mikrocirkulation har gjort det svært at få fysiologiske data på dette område.

En vigtig pointe i animalske forberedelse skridt er fiksering afleveren på en plastplade. Løse Fastgørelses resulterer i leveren bevægelse synkroniseret med respiration, som interfererer med mikroskopisk observation, og gør analyse vanskelig. Stram fiksering forårsager imidlertid blodgennemstrømning stasis. Blodstrømningshastigheder betingelser bør observeres gennem et energibesparende mikroskop under den operative procedure. High-power laser let skade mikrokar, så at frekvensen af ​​bestrålingen bør minimeres. 1 Hz er normalt nok til tidsmæssige måling ^8. Imidlertid en enkelt måling af _pO2 tager mindre end 1 ms, hvilket betyder, at repetitionsfrekvensen kan forøges til 1 kHz til hurtig _pO2 ændringer, som det er nødvendigt. Endvidere fotokemisk reaktion af Pd-TCPP genererer singlet oxygen, som skader mikrokar og inducerer blodpladeaggregering ^9. Kombinationen af fluorescensimagografi og PO ₂ måling kan måle blod strømningsdynamik og oxygenkoncentration alle sammen. Den kviksølvlampe bestrålingspændende FITC også exciterer Pd-TCPP imidlertid, hvorved der genereres meget singlet oxygen, og som fører til blodgennemstrømning stasis. Når både blodgennemstrømning og oxygenspænding måles i det samme dyr, bør FITC billeddannelse udføres før Pd-TCPP administreres. Derudover systemiske iltindholdet er indikativ for oxygenforbrug i vævet. Det er at foretrække at udføre respiratoriske forvaltning i eksperimenter eller analysere blod gas niveauer efter eksperimenter.

Vi anvendte APAP at inducere akut hepatitis, dels fordi en høj dosis af APAP vides at føre til cellenekrose i pericentral område ^10. Delvis ilt trykmåling viste 20,9-mmHg pO ₂ forskel mellem portal vener og centrale venuler i kontrol mus faldt til 16,9 mmHg i APAP-behandlede mus, og at PO ₂ var højere i hele den hepatiske mikrocirkulationen. Den ilt gradient i leverens mikrocirkulation er hovedsagelig et resultat af ilt supplIED fra portal vener, som forbruges i hepatocytter. Den højere dosis af APAP inducerer nekrose i pericentral område ^{11, 12,} og som kan nedsætte oxygenforbrug nedstrøms som vist i figur 3c. At bestemme detaljerede mekanismer, der ligger leveren hepatitis, især forholdet mellem vævsnekrose og oxygen niveau kvantificering af omfanget af nekrose, og serumniveauer af bilirubin, ALT, AST og inflammatoriske cytokiner skal måles. En masse af leversygdomme er relateret til hepatisk mikrocirkulation, med andre ord, at blodstrømmen fordeling, oxygen levering og oxygenforbrug i levervæv. I tilfælde af kronisk indtagelse af alkohol, er omkring 10-15% alkohol metaboliseres af mikrosomale ethanol-oxiderende system og alkohol-inducerede molekyle P450IIE1 genererer NAPQI ^13, en toksisk metabolit, som fører til pericentral hepatocyt nekrose ^14.

Afslutningsvis vores optisk measurement fremgangsmåde kan anvendes til at undersøge fysiologiske og patologiske mekanismer ved at analysere mikrovaskulær struktur diameter, blod strømningshastighed og oxygenspænding.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pd(II) meso-Tetra(4-carboxyphenyl)porphine	Frontier Scientific, Inc.	PdT790
Fluorescein isothiocyanate isomer I	Sigma-Aldrich Co.	F7250
Acetaminophen	Sigma-Aldrich Co.	A7085
Equipment
photomultiplier tube	hamamatsu photonics k.k	H10722-20