Formulations pour la lyophilisation des bactéries et leur influence sur la survie des cellules
Summary
La lyophilisation est souvent un moyen facile et pratique d'obtenir des produits secs de cellules bactériennes viables. Un problème de ce processus est la survie cellulaire. Nous détaillons ici une procédure pour étudier comment la survie des cellules pendant la lyophilisation est influencée par les propriétés de la formulation utilisée.
Abstract
Eau cellulaire peut être retiré pour inactiver les microorganismes réversible pour faciliter le stockage. Une telle méthode de suppression est la lyophilisation, qui est considéré comme une méthode de déshydratation douce. Pour faciliter la survie des cellules pendant le séchage, les cellules sont souvent préparées à l'avance. La formulation forme une matrice qui intègre les cellules et les protège contre divers stress nuisibles imposées sur les cellules lors de la congélation et le séchage. Nous présentons ici une méthode générale pour évaluer le taux de survie des cellules après lyophilisation et nous l'illustrons en comparant les résultats obtenus avec quatre formulations différentes: le saccharose disaccharide, le saccharose dérivé polymère Ficoll PM400, et les polysaccharides respectifs hydroxyéthylcellulose (HEC ) et de l'hydroxypropyl méthyl cellulose (HPMC), sur deux souches de bactéries, de P. putida KT2440 et A. A6 chlorophenolicus. Dans ce travail, nous illustrons comment préparer des formulations pour la lyophilisation et la façon d'enquêter sur la mécaniqueismes de la survie des cellules après réhydratation en caractérisant la formulation en utilisant la calorimétrie différentielle à balayage (DSC), les mesures de tension de surface, analyse aux rayons X et microscopie électronique et concernant ces données à taux de survie. Les polymères ont été choisis de façon à obtenir une structure monomère de la saccharose ressemblant à de polysaccharide correspondant à un des degrés divers. En utilisant cette méthode setup nous avons montré que les polymères peuvent soutenir la survie cellulaire aussi efficacement que disaccharides si certaines propriétés physiques de la formulation sont contrôlées 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le motif de cette étude était d'étudier certaines propriétés de formulation qui peuvent être d'importance pour la survie des cellules pendant la lyophilisation. Bien que la tolérance intrinsèque de séchage varie selon les espèces, comme illustré à la figure 1A, la tendance de la façon dont les formulations différentes soutien survie cellulaire est similaire. Il est instructif de commencer par une comparaison de saccharose et de Ficoll. On croit qu'un facteur clé pour une formu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travail a été soutenu par la Fondation suédoise pour la recherche stratégique environnementale (Mistra) à travers le programme DOM et Grant 211684 (BACSIN) du programme-cadre de l'Union européenne Communauté 7e PC. Nous remercions J. Engstrand de l'aide pour filmer l'analyse aux rayons X et L. Tang pour aider avec le récit conceptuel.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Ficoll PM 400 | GE-healthcare | 17-0300-10 | |
| HEC (Natrosol-M Pharm Grade) | Ashland | Gift from Ashland | |
| HPMC (Methocel F4M) | Dow | Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S2395 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
| Tryptic Soy broth | Merck | 105459 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck | 105458 | |
| Lyostar II | FTS Kinetics | N.A. | |
| Pyris Diamond DSC | Perkin-Elmer | N.A. | |
| Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer | Bruker | N.A | |
| Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM | FEI | N.A | |
| Krüss Educational Tensiometer | Krüss | N.A. |
References
- Wessman, P., Mahlin, D., et al. Impact of matrix properties on the survival of freeze-dried bacteria. J. Sci. Food Agric. 91 (14), 2518-2528 (2011).
- Ablett, S., Izzard, M. J., et al. Differential Scanning Calorimetric Study of Frozen Sucrose and Glycerol Solutions. Journal of the Chemical Society-Faraday Transactions. 88 (6), 789-794 (1992).
- Knopp, S. A., Chongprasert, S., et al. The relationship between type TMDSC curve of frozen sucrose solutions and collapse during freeze-drying. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 54 (2), 659-672 (1998).
- Crowe, J. H., Leslie, S. B., et al. Is Vitrification Sufficient to Preserve Liposomes during Freeze-Drying. Cryobiology. 31 (4), 355-366 (1994).
- Jain, P., Sen, S., et al. Effect of glass-forming biopreservatives on head group rotational dynamics in freeze-dried phospholipid bilayers: A P-31 NMR study. Journal of Chemical Physics. 131 (2), (2009).
- Stock, J. B., Rauch, B., et al. Periplasmic Space in Salmonella-Typhimurium and Escherichia-Coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (21), 7850-7861 (1977).
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., et al. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54, 579-599 (1992).
- Leslie, S. B., Israeli, E., et al. Trehalose and Sucrose Protect Both Membranes and Proteins in Intact Bacteria during Drying. Applied and Environmental Microbiology. 61 (10), 3592-3597 (1995).
- Nesarikar, V. V., Nassar, M. N. Effect of cations and anions on glass transition temperatures in excipient solutions. Pharmaceutical Development and Technology. 12 (3), 259-264 (2007).
- You, Y., Ludescher, R. D. The effect of sodium chloride on molecular mobility in amorphous sucrose detected by phosphorescence from the triplet probe erythrosin B. Carbohydr. Res. 343 (2), 350-363 (2008).
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Nguyen, K. H. N., Crowe, L. M. Is vitrification involved in depression of the phase transition temperature in dry phospholipids. Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 1280, 187-196 (1996).
