Formulazioni per la liofilizzazione di batteri e la loro influenza sulla sopravvivenza cellulare
Summary
Liofilizzazione è spesso un modo semplice e conveniente per ottenere prodotti a secco di cellule batteriche vitali. Un problema del processo è la sopravvivenza delle cellule. Abbiamo dettaglio qui una procedura per indagare come sopravvivenza cellulare durante la liofilizzazione è influenzata dalle proprietà della formulazione utilizzata.
Abstract
Acqua cellulare può essere rimosso per inattivare microrganismi reversibilmente esigenze di stoccaggio. Uno di questi metodi di rimozione è liofilizzazione, che è considerato un metodo di disidratazione delicato. Per facilitare la sopravvivenza cellulare durante l'asciugatura, le cellule sono spesso formulate in anticipo. La formulazione forma una matrice che incorpora le cellule e le protegge da varie sollecitazioni dannose imposte alle cellule durante il congelamento e l'essiccazione. Presentiamo qui un metodo generale per valutare il tasso di sopravvivenza delle cellule dopo liofilizzazione e illustriamo lo confrontando i risultati ottenuti con quattro diverse formulazioni: disaccaride saccarosio, il saccarosio derivato polimero Ficoll PM400, e le rispettive polisaccaridi idrossietilcellulosa (HEC ) e idrossipropilmetilcellulosa (HPMC), su due ceppi di batteri, P. putida KT2440 e A. A6 chlorophenolicus. In questo lavoro si illustra come preparare formulazioni per la liofilizzazione e il modo di indagare la meccanicaismi della sopravvivenza cellulare dopo la reidratazione caratterizzando la formulazione di usando calorimetria a scansione differenziale (DSC), misure di tensione superficiale, analisi a raggi X e microscopia elettronica e tali dati relativi ai tassi di sopravvivenza. I polimeri sono stati scelti per ottenere una struttura monomerica del rispettivo saccarosio polisaccaride simile ad una misura diversa. Usando questa configurazione metodo abbiamo dimostrato che polimeri possono supportare la sopravvivenza cellulare nel modo più efficace disaccaridi se certe proprietà fisiche della formulazione sono controllate 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il motivo di questo studio era di studiare alcune proprietà di formulazione che possono essere di importanza per la sopravvivenza delle cellule durante la liofilizzazione. Sebbene la tolleranza asciugatura intrinseco varia tra specie diverse, come illustrato nella Figura 1A, la tendenza da quanto la formulazioni differente supporto sopravvivenza cellulare è simile. È istruttivo per iniziare con un confronto di saccarosio e di Ficoll. Si ritiene che un fattore chiave per una formulazione per supportar…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Svedese per la Ricerca Ambientale Strategica (MISTRA) attraverso il programma di DOM e Grant 211684 (BACSIN) dal programma quadro della Comunità europea del 7 ° PQ. Ringraziamo J. Engstrand per l'assistenza a filmare l'analisi a raggi X e L. Tang per aiutare con la narrazione concettuale.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Ficoll PM 400 | GE-healthcare | 17-0300-10 | |
| HEC (Natrosol-M Pharm Grade) | Ashland | Gift from Ashland | |
| HPMC (Methocel F4M) | Dow | Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S2395 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
| Tryptic Soy broth | Merck | 105459 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck | 105458 | |
| Lyostar II | FTS Kinetics | N.A. | |
| Pyris Diamond DSC | Perkin-Elmer | N.A. | |
| Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer | Bruker | N.A | |
| Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM | FEI | N.A | |
| Krüss Educational Tensiometer | Krüss | N.A. |
References
- Wessman, P., Mahlin, D., et al. Impact of matrix properties on the survival of freeze-dried bacteria. J. Sci. Food Agric. 91 (14), 2518-2528 (2011).
- Ablett, S., Izzard, M. J., et al. Differential Scanning Calorimetric Study of Frozen Sucrose and Glycerol Solutions. Journal of the Chemical Society-Faraday Transactions. 88 (6), 789-794 (1992).
- Knopp, S. A., Chongprasert, S., et al. The relationship between type TMDSC curve of frozen sucrose solutions and collapse during freeze-drying. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 54 (2), 659-672 (1998).
- Crowe, J. H., Leslie, S. B., et al. Is Vitrification Sufficient to Preserve Liposomes during Freeze-Drying. Cryobiology. 31 (4), 355-366 (1994).
- Jain, P., Sen, S., et al. Effect of glass-forming biopreservatives on head group rotational dynamics in freeze-dried phospholipid bilayers: A P-31 NMR study. Journal of Chemical Physics. 131 (2), (2009).
- Stock, J. B., Rauch, B., et al. Periplasmic Space in Salmonella-Typhimurium and Escherichia-Coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (21), 7850-7861 (1977).
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., et al. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54, 579-599 (1992).
- Leslie, S. B., Israeli, E., et al. Trehalose and Sucrose Protect Both Membranes and Proteins in Intact Bacteria during Drying. Applied and Environmental Microbiology. 61 (10), 3592-3597 (1995).
- Nesarikar, V. V., Nassar, M. N. Effect of cations and anions on glass transition temperatures in excipient solutions. Pharmaceutical Development and Technology. 12 (3), 259-264 (2007).
- You, Y., Ludescher, R. D. The effect of sodium chloride on molecular mobility in amorphous sucrose detected by phosphorescence from the triplet probe erythrosin B. Carbohydr. Res. 343 (2), 350-363 (2008).
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Nguyen, K. H. N., Crowe, L. M. Is vitrification involved in depression of the phase transition temperature in dry phospholipids. Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 1280, 187-196 (1996).
