Formuleringer til frysetørring af bakterier og deres indflydelse på Cell Survival
Summary
Frysetørring er ofte en nem og bekvem måde at opnå tørre produkter af levedygtige bakterieceller. Et spørgsmål i processen er celleoverlevelse. Vi detaljer her en fremgangsmåde til at undersøge, hvordan celleoverlevelse under frysetørring påvirkes af egenskaberne af den anvendte formulering.
Abstract
Cellular vand kan fjernes reversibelt inaktivere mikroorganismer for at lette opbevaring. En sådan metode til fjernelse er frysetørring, hvilket betragtes som en blid dehydrering metode. For at lette celle overlevelse under tørring er cellerne ofte formuleret på forhånd. Formuleringen danner en matrix, der integrerer cellerne og beskytter dem mod forskellige skadelige spændinger pålagt celler under frysning og tørring. Vi præsenterer her en generel metode til at vurdere overlevelsen af celler efter frysetørring og vi illustrere det ved at sammenligne de opnåede resultater med fire forskellige formuleringer: disaccharidet saccharose indholdet af saccharose afledt polymer Ficoll PM400, og de respektive polysaccharider hydroxyethylcellulose (HEC ) og hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), på to bakteriestammer, P. putida KT2440 og A. chlorophenolicus A6. I dette arbejde har vi illustrere, hvordan man forbereder formuleringer til frysetørring og hvordan at undersøge mekaismer celle overlevelse efter rehydrering ved at karakterisere formuleringen hjælp af differential (DSC), overfladespænding målinger, røntgen analyse og elektronmikroskopi, og som vedrører disse data til overlevelsesrater. Polymererne blev valgt for at få en monomer struktur af de respektive polysaccharid ligner saccharose til en varierende grad. Med denne metode opsætning viste vi, at polymerer kan understøtte celleoverlevelse så effektivt som disaccharider, hvis visse fysiske egenskaber af formuleringen kontrolleres 1..
Protocol
Representative Results
Discussion
Motivet for denne undersøgelse var at undersøge nogle formulerings egenskaber, der kan være af betydning for celle overlevelse under frysetørring. Selv om den iboende tørring tolerance varierer mellem forskellige arter, som illustreret i figur 1A, er tendensen, hvor godt de forskellige formuleringer bærecellen overlevelse er ens. Det er informativt at starte med en sammenligning af saccharose og Ficoll. Det menes, at en afgørende faktor for en formulering at understøtte celleoverlevelse er evnen…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet blev støttet af den svenske Foundation for Strategic Environmental Research (MISTRA) gennem DOM programmet og Grant 211.684 (BACSIN) fra Den Europæiske Union EF-FP7 rammeprogrammet. Vi takker J. Engstrand om bistand til at filme den røntgen-analyse og L. Tang for at hjælpe med den konceptuelle fortælling.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Ficoll PM 400 | GE-healthcare | 17-0300-10 | |
| HEC (Natrosol-M Pharm Grade) | Ashland | Gift from Ashland | |
| HPMC (Methocel F4M) | Dow | Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S2395 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
| Tryptic Soy broth | Merck | 105459 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck | 105458 | |
| Lyostar II | FTS Kinetics | N.A. | |
| Pyris Diamond DSC | Perkin-Elmer | N.A. | |
| Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer | Bruker | N.A | |
| Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM | FEI | N.A | |
| Krüss Educational Tensiometer | Krüss | N.A. |
References
- Wessman, P., Mahlin, D., et al. Impact of matrix properties on the survival of freeze-dried bacteria. J. Sci. Food Agric. 91 (14), 2518-2528 (2011).
- Ablett, S., Izzard, M. J., et al. Differential Scanning Calorimetric Study of Frozen Sucrose and Glycerol Solutions. Journal of the Chemical Society-Faraday Transactions. 88 (6), 789-794 (1992).
- Knopp, S. A., Chongprasert, S., et al. The relationship between type TMDSC curve of frozen sucrose solutions and collapse during freeze-drying. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 54 (2), 659-672 (1998).
- Crowe, J. H., Leslie, S. B., et al. Is Vitrification Sufficient to Preserve Liposomes during Freeze-Drying. Cryobiology. 31 (4), 355-366 (1994).
- Jain, P., Sen, S., et al. Effect of glass-forming biopreservatives on head group rotational dynamics in freeze-dried phospholipid bilayers: A P-31 NMR study. Journal of Chemical Physics. 131 (2), (2009).
- Stock, J. B., Rauch, B., et al. Periplasmic Space in Salmonella-Typhimurium and Escherichia-Coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (21), 7850-7861 (1977).
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., et al. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54, 579-599 (1992).
- Leslie, S. B., Israeli, E., et al. Trehalose and Sucrose Protect Both Membranes and Proteins in Intact Bacteria during Drying. Applied and Environmental Microbiology. 61 (10), 3592-3597 (1995).
- Nesarikar, V. V., Nassar, M. N. Effect of cations and anions on glass transition temperatures in excipient solutions. Pharmaceutical Development and Technology. 12 (3), 259-264 (2007).
- You, Y., Ludescher, R. D. The effect of sodium chloride on molecular mobility in amorphous sucrose detected by phosphorescence from the triplet probe erythrosin B. Carbohydr. Res. 343 (2), 350-363 (2008).
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Nguyen, K. H. N., Crowe, L. M. Is vitrification involved in depression of the phase transition temperature in dry phospholipids. Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 1280, 187-196 (1996).
