وصفنا بروتوكول للفي الوقت الحقيقي videoimaging للهجرة الخلايا العصبية في الدماغ الأمامي الماوس. وسجلت هجرة الخلايا العصبية السلائف فيروسي أو المطعمة التي تحمل علامات في حي شرائح واسعة باستخدام الحاد مجال التصوير الفلورسنت مع فاصل زمني سريع نسبيا اقتناء لدراسة المراحل المختلفة للهجرة الخلايا، بما في ذلك فترات من مراحل ثابتة والهجرة وسرعة الهجرة.
هناك مجموعة كبيرة من الأدلة تشير إلى أن يتم إنشاء جوهري الخلايا العصبية وظيفية جديدة من حمام سباحة داخلي المنشأ من الخلايا الجذعية العصبية في المناطق المحظورة من الدماغ الثدييات الكبار. neuroblasts حديثي الولادة من منطقة subventricular (SVZ) تهاجر على طول مجرى منقاري المهاجرة (RMS) إلى وجهتها النهائية في البصلة الشمية (OB) 1. في RMS، neuroblasts ترحيل عرضية في سلاسل مغمد من خلال عمليات نجمي 2،3 باستخدام الأوعية الدموية كوسيلة لدعم الهيكلية ومصدر من العوامل الجزيئية اللازمة للهجرة 4،5. في OB، neuroblasts فصل من سلاسل وترحيل شعاعيا في طبقات مختلفة بصلي حيث تفرق في interneurons والاندماج في الشبكة القائمة 1 و 6.
في هذا المخطوط وصفنا إجراءات الهجرة خلية الرصد في شرائح حاد في الدماغ القوارض. استخدام شرائح الحادة يسمح للassessmالأنف والحنجرة الهجرة خلية في المكروية التي تشبه ارتباطا وثيقا في ظروف المجراة في مناطق الدماغ التي يصعب الوصول إليها لفي الجسم الحي التصوير. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يتجنب حالة زراعة طويلة كما في حالة الثقافات عضوي النمط والخلية التي قد تغير في نهاية المطاف خصائص هجرة الخلايا. يمكن السلائف الخلايا العصبية الحادة في شرائح تصور باستخدام البصريات DIC أو البروتينات الفلورية. وضع العلامات الفيروسية السلائف الخلايا العصبية في SVZ، تطعيم neuroblasts من الفئران مراسل في SVZ من البرية من نوع الفئران، والفئران المعدلة وراثيا باستخدام البروتين التي تعبر عن الفلورية في neuroblasts كلها أساليب مناسبة لتصور neuroblasts وبعد هجرتهم. الأسلوب في وقت لاحق، ومع ذلك، لا يسمح لتعقبها الخلايا الفردية لفترات طويلة من الوقت بسبب كثافة عالية من الخلايا المسمى. استخدمنا اسعة المجال المجهر تستقيم الفلورسنت مجهزة الكاميرا CCD لتحقيق فاصل زمني سريع نسبيا اقتناء (واحد IMAجنرال الكتريك كل ثانية 15 أو 30) لتحديد موثوق ثابتة ومراحل المهاجرة. A تحديد دقيق للمدة الأطوار الثابتة والمهاجرة أمر حاسم لا لبس فيه لتفسير النتائج. ونحن أيضا تنفيذ عدة عمليات الاستحواذ خطوة Z-لرصد neuroblasts الهجرة في 3D. وقد استخدم على نطاق واسع مجال التصوير الفلورسنت لتصور الهجرة العصبية 7-10. هنا، نحن تصف بروتوكول مفصلة لوصفها neuroblasts، وأداء الفيديو في الوقت الحقيقي التصوير الهجرة أرومة عصبية حادة في شرائح من الدماغ الأمامي الماوس الكبار، وتحليل الهجرة الخلية. في حين أن البروتوكول وصف مثالا للهجرة neuroblasts في RMS الكبار، فإنه يمكن أيضا أن تستخدم لمتابعة الهجرة خلية في المخ بعد الولادة الجنينية والمبكر.
استهداف الصحيح السلائف الخلايا العصبية إلى مناطق الدماغ المناسب هو عملية الأساسية التي تقوم عليها الجمعية السليم وظيفة الدارات العصبية. الغالبية العظمى من الخلايا تهاجر أثناء التطور الجنيني وبعد الولادة في الدماغ إلا في مناطق قليلة، مثل التلفيف، OB المسنن والمخيخ،…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الكندية منحة الصحة (CIHR) بحوث لASJK كان مدعوما جزئيا زمالة جامعة لافال. وكما هو حاصل على كرسي أبحاث كندا في تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Sucrose | Sigma | S9378 |
Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 |
NaCI | Sigma | S9625 |
KCI | Sigma | P9541 |
MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 |
NaHCO3 | Sigma | S5761 |
NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 |
CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 |
Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 |
Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 |
Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 |
HEPES | Sigma | H3375 |
HBSS | Gibco | 14170-112 |
DNase I | Sigma | D-5025 |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
BSA | EMD | 2930 |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 |
Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 |
Pasteur pipette | VWR | 14672-380 |
15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 |
50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 |
Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 |
Paraffin oil | EMD | PX0045-3 |
Proviodine | Rougier | 65655-1370 |
Suture | Stoelting | 50487 |
Anafen | CDMV | 11508 |
20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 |
Petri dish | VWR | 25384-094 |
Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 |
Glue | Permabond | 910 |
95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 |
Blade | WPI | 501901 |
Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 |
Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 |
Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 |
Nanoliter injector | WPI | B203MC4 |
Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 |
Micro drill system | WPI | 501819 |
Vibratome | Thermo Scientific | 920110 |
Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF |
CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D |
Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 |
PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 |
Heating system | Warner Instruments | TC-344B |
40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 |
10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 |
Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF |
MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 |
Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |