Time-lapse imaging van neuroblast migratie in Acute Schijfjes van de volwassen muis voorhersenen

Summary

We beschrijven een protocol voor real-time videoimaging van neuronale migratie in de muis voorhersenen. De migratie van viraal gemerkte of geënte neuronale precursors opgenomen in acute levende plakjes met breedveld fluorescerende beeldvorming met een relatief snelle verwerving interval de verschillende fasen van celmigratie, zoals de duur van de stationaire en migratiefasen en de snelheid van bestuderen migratie.

Abstract

Er is een groot aantal cijfers blijkt dat aangeeft dat nieuwe functionele neuronen constitutief zijn gegenereerd op basis van een endogene pool van neurale stamcellen in beperkte gebieden van de volwassen hersenen van zoogdieren. Pasgeboren neuroblasten van de subventriculaire zone (SVZ) migreren langs de rostrale migratie stroom (RMS) naar hun eindbestemming in de bulbus olfactorius (OB) ^1. In de RMS, neuroblasten tangentiaal migreren in ketens ensheathed door astrocytische processen met ^2,3 bloedvaten als structurele steun en een bron van moleculaire factoren vereist voor migratie ^4,5. In de OB, neuroblasten los van de ketens en migreren radiaal in de verschillende bulbaire lagen er te differentiëren in interneuronen en te integreren in het bestaande netwerk ^{1, 6.}

In dit manuscript beschrijven we de procedure voor toezicht celmigratie in acute plakken van het knaagdier hersenen. Het gebruik van acute segmenten kan de assessment van celmigratie in de micro-omgeving die nauw lijken op in vivo omstandigheden en in hersengebieden die moeilijk toegankelijk zijn voor in vivo imaging. Bovendien voorkomt lange kweken voorwaarde bij organotypische en celkweken die uiteindelijk kunnen veranderen de migratie-eigenschappen van de cellen. Neuronale voorlopers in acute plakjes kan worden gevisualiseerd met behulp van DIC optiek of fluorescerende eiwitten. Virale labeling van neuronale precursors in de SVZ, neuroblasten enten van reporter muizen in de SVZ van wild-type muizen, en transgene muizen die fluorescent eiwit expressie in neuroblasten zijn geschikte werkwijzen voor het visualiseren neuroblasten en na de migratie. De latere methode echter geen afzonderlijke cellen worden bijgehouden voor lange tijd vanwege de hoge dichtheid van gemerkte cellen. We gebruikten een breed gebied fluorescent rechtop microscoop uitgerust met een CCD camera om een ​​relatief snelle acquisitie interval (een ima verwezenlijkenge elke 15 of 30 sec) om betrouwbaar identificeren stationaire fasen en migratie. Een exacte beschrijving van de duur van de stationaire en trekkende fasen is cruciaal voor de eenduidige interpretatie van de resultaten. We hebben ook uitgevoerd meerdere z-stap overnames om neuroblasten migratie in 3D te volgen. Wide-field fluorescerende beeldvorming is uitgebreid gebruikt om neuronale migratie visualiseren ^7-10. We beschrijven gedetailleerd protocol voor het labelen neuroblasten, uitvoeren real-time video-imaging van neuroblast migratie acute plakken van de volwassen muis voorhersenen en analyseren celmigratie. Hoewel de beschreven protocol voorbeeld de migratie van neuroblasten in de volwassen RMS kan ook worden gebruikt om celmigratie volgen embryonale en vroege postnatale hersenen.

Protocol

1. Labeling Neuronale Voorlopers Neuroblasten kunnen worden gevisualiseerd met behulp van transgene muizen die selectief fluorescerende eiwitten tot expressie brengen in neuroblasten (dwz Dcx-GFP, Gad67-GFP), door stereotaxically injecteren virale deeltjes codeert fluorescerende eiwitten in de SVZ of RMS of door het enten van neuronale precursors reporter muizen (dwz , Dcx-GFP, Gad67-GFP) in de SVZ van wild-type muizen. We beschrijven de procedure voor het enten en vira…

Discussion

De juiste targeting van neuronale precursors de juiste hersengebieden is een fundamenteel proces achter de juiste assemblage en functie van neurale circuits. De meeste cellen migreren tijdens de embryonale ontwikkeling en de postnatale hersenen slechts enkele regio's, zoals de OB, dentate gyrus en cerebellum, neuronale verplaatsing nog steeds plaats. De mechanismen orkestreren celmigratie in de postnatale hersenen blijven echter slecht begrepen. Kennis van de mechanismen en moleculaire pathways die betrokken zijn in…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose (ACSF)	EMD	DX0145-3
NaCI	Sigma	S9625
KCI	Sigma	P9541
MgCI2x6H2O	Sigma-Aldrich	M2670
NaHCO3	Sigma	S5761
NaH2PO4xH2O	EMD	SX0710-1
CaCI2x2H2O	Sigma-Aldrich	C3881
Dextran TexasRed	Invitrogen	D1864
Dextran CascadeBlue	Invitrogen	D1976
Glucose (40X solution)	Sigma	G8769
Sodium pyruvat	Gibco	11360-070
HEPES	Sigma	H3375
HBSS	Gibco	14170-112
DNase I	Sigma	D-5025
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
BSA	EMD	2930
Pen/Strep	Life Technologies	15140-122
Ketamine/Xylazine	CDMV	5230
Pasteur pipette	VWR	14672-380
15 ml conical tube	Sarstedt	62.553.205
50 ml conical tube	Sarstedt	62.547.205
Glass capillaries (stereotaxic injection)	WPI	4878
Paraffin oil	EMD	PX0045-3
Proviodine	Rougier	65655-1370
Suture	Stoelting	50487
Anafen	CDMV	11508
20 cc Syringe	VWR	SS-20L2
Petri dish	VWR	25384-094
Agar	Laboratoire Mat	AP-0108
Glue	Permabond	910
95% O2/5% CO2	Linde	24068835
Blade	WPI	501901
Nylon mesh	Warner Instruments	64-0198
Centrifuge	Eppendorf	5702 000.019
Pipette puller	Sutter Instrument	P-97
Nanoliter injector	WPI	B203MC4
Stereotaxic injection apparatus	WPI	502900
Micro drill system	WPI	501819
Vibratome	Thermo Scientific	920110
Wide-field fluorescent microscope	Olympus	BX61WIF
CCD camera	Photometrics	CS-HQ2-D
Ultra-quiet imaging chamber	Harvard Apparatus	64-1487
PH-1 Series 20 heater platform	Harvard Apparatus	64-0284
Heating system	Warner Instruments	TC-344B
40X water immersion objective	Olympus	1-UM587
10X water immersion objective	Olympus	1-UM583
Lambda DG-4	Sutter Instruments	DG-4/OF
MetaMorph software	Molecular Devices	40000
Imaris software	Bitplane	BPI-IM70-F1