Les îlots de rongeurs évaluation de la réplication et la fonction des cellules bêta dans Adenovirally transduites isolées

Summary

Ce protocole permet d'identifier les facteurs qui modulent fonctionnelle masse des cellules bêta de trouver des cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement du diabète. Le protocole consiste en une méthode simplifiée pour évaluer la réplication des îlots et la fonction des cellules bêta des îlots de Langerhans isolés de rat après la manipulation de l'expression des gènes par des adénovirus.

Abstract

L'homéostasie du glucose est principalement contrôlée par les hormones du système endocrinien de l'insuline et le glucagon, sécrété par la version bêta du pancréas et des cellules alpha, respectivement. Fonctionnelle masse des cellules bêta est déterminée par la masse des cellules bêta anatomique ainsi que la capacité des cellules bêta pour répondre à une charge en éléments nutritifs. Une perte de masse des cellules bêta fonctionnelles est au cœur de ces deux formes principales de diabète ^1-3. Considérant que les résultats en déclin bêta fonctionnelles de masse de cellules à partir d'une attaque auto-immune de type 1 du diabète, dans le diabète de type 2, cette décroissance se développe à la fois une incapacité des cellules bêta à sécréter de l'insuline de façon appropriée et la destruction des cellules bêta à partir d'un cadre de mécanismes. Ainsi, les efforts visant à restaurer la fonctionnalité de masse des cellules bêta sont primordiaux pour un meilleur traitement des cures et potentiels pour le diabète.

Des efforts sont en cours pour identifier les voies moléculaires qui peuvent être exploitées afin de stimuler la réplication et d'améliorer la fonction des cellules bêta.Idéalement, les objectifs thérapeutiques permettrait d'améliorer à la fois la croissance des cellules bêta et la fonction. Peut-être plus important, cependant, c'est de déterminer si une stratégie qui stimule la croissance des cellules bêta se fait au prix de la fonction des cellules bêta atteinte (par exemple avec certains oncogènes) et vice-versa.

Par systématiquement la suppression ou la surexpression de l'expression de gènes cibles dans les îlots isolés de rat, on peut identifier des cibles thérapeutiques potentielles pour augmenter la masse des cellules bêta fonctionnelles ^4-6. Des vecteurs adénoviraux peut être utilisé à des protéines efficacement surexpriment ou démontable en îlots isolés de rat ^4,7-15. Ici, nous présentons une méthode pour manipuler l'expression des gènes en utilisant transduction adénovirale et d'évaluer la réplication des îlots et la fonction des cellules bêta des îlots de Langerhans isolés de rat (figure 1). Cette méthode a été utilisée précédemment pour identifier de nouvelles cibles qui modulent la réplication des cellules bêta ou la fonction ^{5,6,8,9,16,17.}

Protocol

1. Transduction adénovirale et la culture d'îlots de rats Préparer une plaque à 6 puits de culture tissulaire non revêtu par addition de 2 ml de milieu (RPMI 1640 contenant 8 mM de glucose, 10% de sérum bovin foetal, de 50 unités / ml de pénicilline, et 50 mg / ml de streptomycine) au nombre requis de puits. Par exemple, une expérience typique peut exiger trois puits – un de chaque pour un contrôle sans virus, un contrôle du virus (par exemple, GFP-exprimer adénovirus), et le groupe expérimen…

Discussion

Établir des voies qui peuvent être modulés afin de stimuler la réplication et d'améliorer la fonction des cellules bêta sont pertinentes pour les deux principales formes de diabète. Parce que fonctionnelle masse des cellules bêta est tributaire de l'existence et la fonction de cellules sécrétrices d'insuline, l'évaluation de ces déterminants a simultanément ses avantages. Ce protocole décrit un protocole simplifié pour déterminer si la surexpression ou la suppression d'une protéine c…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
RPMI 1640 media	Gibco	11879
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140
6-well plate	BD-Falcon	35-1146	Non-TC treated
[methyl-3H]-thymidine	Perkin Elmer	NET027Z001MC	1 mCi/ml
Micro-centrifuge tubes	Denville	C2170	1.7 ml
NaCl	Sigma	59888
KCl	Acros	42409
KH2PO4	Acros	20592
MgSO4	Acros	41348
CaCl2	Acros	34961
HEPES	Sigma	H0887	1 M solution
35% BSA	Sigma	A7979
NaHCO3	Acros	42427
d-glucose	Sigma	G8769
TCA	Fisher Scientific	SA9410-1	10% w/v
NaOH	Acros	12426
Scintillation counting tube	Sarstedt	58.536	7 ml, PP
Scintillation counting tube cap	Sarstedt	65.816
Econo-Safe counting cocktail	RPI	111175
Insulin RIA	Siemens	TKIN2
BCA Assay Kit	Thermo Scientific	23250
			Equipment
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Scintillation counting tube rack	Sarstedt	93.1431.001
Liquid scintillation counter	Perkin Elmer	Tri-Carb 2910TR