Isolotti roditori Valutazione di replica e la funzione delle cellule beta in Adenovirally-trasdotte Isolati
Summary
Questo protocollo permette di identificare fattori che modulano funzionale massa delle cellule beta per trovare potenziali bersagli terapeutici per il trattamento del diabete. Il protocollo consiste in un metodo semplificato per valutare la replicazione delle isole e la funzione delle cellule beta in isole di ratto isolati dopo manipolazione genica con adenovirus.
Abstract
Omeostasi del glucosio è principalmente controllata dal sistema endocrino gli ormoni insulina e glucagone, secreto dal pancreas beta e le cellule alfa, rispettivamente. Functional massa di cellule beta è determinata dalla massa anatomica cellule beta così come la capacità delle cellule beta per rispondere a un carico di nutrienti. Una perdita di massa funzionale delle cellule beta è fondamentale per entrambe le forme principali di diabete 1-3. Considerando che i risultati in declino funzionale massa di cellule beta da un attacco autoimmune nel diabete tipo 1, diabete di tipo 2, questo decremento si sviluppa sia da una incapacità delle cellule beta di secernere insulina in modo appropriato e la distruzione delle cellule beta da una squadra di meccanismi. Pertanto, gli sforzi per ristabilire la massa funzionale delle cellule beta sono di primaria importanza al trattamento migliore e potenziali cure per il diabete.
Gli sforzi sono in corso per identificare i meccanismi molecolari che possono essere sfruttate per stimolare la replicazione e migliorare la funzione delle cellule beta.Idealmente, gli obiettivi terapeutici potrebbe migliorare sia la crescita e la funzione delle cellule beta. Forse ancora più importante però è quello di identificare se una strategia che stimola la crescita delle cellule beta arriva al costo di compromettere la funzione delle cellule beta (come nel caso di alcuni oncogeni) e viceversa.
Sistematicamente la soppressione o sovraespressione l'espressione di geni bersaglio in isole isolate di ratto, si possono identificare potenziali bersagli terapeutici per aumentare la massa funzionale delle cellule beta 4-6. I vettori adenovirali possono essere impiegati per proteine efficiente esprimono molti o smontabile in isole di ratto isolati 4,7-15. Qui, presentiamo un metodo per modificare l'espressione genica utilizzando trasduzione adenovirale e valutare la replicazione e la funzione delle cellule insulari beta in isole di ratto isolati (Figura 1). Questo metodo è stato utilizzato in precedenza per identificare nuovi bersagli che modulano la replicazione delle cellule beta o una funzione 5,6,8,9,16,17.
Protocol
Discussion
Stabilire percorsi che possono essere modulate per stimolare la replicazione e migliorare la funzione delle cellule beta sono importanti per entrambe le forme principali di diabete. Poiché funzionale massa di cellule beta dipende dalla esistenza e la funzione di cellule che secernono insulina, valutando questi determinanti simultaneamente ha i suoi vantaggi. Questo protocollo descrive un protocollo semplificato per identificare se la sovraespressione o la soppressione di una proteina porta a variazioni di massa funzion…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione DK078732 dal NIH (per PTF).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| RPMI 1640 media | Gibco | 11879 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 6-well plate | BD-Falcon | 35-1146 | Non-TC treated |
| [methyl-3H]-thymidine | Perkin Elmer | NET027Z001MC | 1 mCi/ml |
| Micro-centrifuge tubes | Denville | C2170 | 1.7 ml |
| NaCl | Sigma | 59888 | |
| KCl | Acros | 42409 | |
| KH2PO4 | Acros | 20592 | |
| MgSO4 | Acros | 41348 | |
| CaCl2 | Acros | 34961 | |
| HEPES | Sigma | H0887 | 1 M solution |
| 35% BSA | Sigma | A7979 | |
| NaHCO3 | Acros | 42427 | |
| d-glucose | Sigma | G8769 | |
| TCA | Fisher Scientific | SA9410-1 | 10% w/v |
| NaOH | Acros | 12426 | |
| Scintillation counting tube | Sarstedt | 58.536 | 7 ml, PP |
| Scintillation counting tube cap | Sarstedt | 65.816 | |
| Econo-Safe counting cocktail | RPI | 111175 | |
| Insulin RIA | Siemens | TKIN2 | |
| BCA Assay Kit | Thermo Scientific | 23250 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Scintillation counting tube rack | Sarstedt | 93.1431.001 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb 2910TR |
References
- Ferrannini, E. beta-Cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 493-500 (2005).
- Weyer, C., Bogardus, C., Mott, D. M., Pratley, R. E. The natural history of insulin secretory dysfunction and insulin resistance in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus. J. Clin. Invest. 104, 787-794 (1999).
- Keenan, H. A. Residual insulin production and pancreatic ss-cell turnover after 50 years of diabetes: Joslin Medalist Study. Diabetes. 59, 2846-2853 (2010).
- Bain, J. R., Schisler, J. C., Takeuchi, K., Newgard, C. B., Becker, T. C. An adenovirus vector for efficient RNA interference-mediated suppression of target genes in insulinoma cells and pancreatic islets of langerhans. Diabetes. 53, 2190-2194 (2004).
- Fueger, P. T. Trefoil factor 3 stimulates human and rodent pancreatic islet beta-cell replication with retention of function. Mol. Endocrinol. 22, 1251-1259 (2008).
- Schisler, J. C. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol. Cell Biol. 28, 3465-3476 (2008).
- Chan, C. B. Overexpression of uncoupling protein 2 inhibits glucose-stimulated insulin secretion from rat islets. Diabetes. 48, 1482-1486 (1999).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53, 149-159 (2004).
- Icyuz, M. Adenovirus infection activates akt1 and induces cell proliferation in pancreatic islets1. Transplantation. 87, 821-824 (2009).
- Kaneto, H. Activation of the hexosamine pathway leads to deterioration of pancreatic beta-cell function through the induction of oxidative stress. J. Biol. Chem. 276, 31099-31104 (2001).
- Antinozzi, P. A., Berman, H. K., O’Doherty, R. M., Newgard, C. B. Metabolic engineering with recombinant adenoviruses. Annu. Rev. Nutr. 19, 511-544 (1999).
- Newgard, C. B., Becker, T. C., Berman, H. K., O’Doherty, R. M. Regulation of overexpressed hexokinases in liver and islet cells. Biochem. Soc. Trans. 25, 118-122 (1997).
- Becker, T. C., BeltrandelRio, H., Noel, R. J., Johnson, J. H., Newgard, C. B. Overexpression of hexokinase I in isolated islets of Langerhans via recombinant adenovirus. Enhancement of glucose metabolism and insulin secretion at basal but not stimulatory glucose levels. J. Biol. Chem. 269, 21234-21238 (1994).
- Csete, M. E. Adenoviral-mediated gene transfer to pancreatic islets does not alter islet function. Transplant Proc. 26, 756-757 (1994).
- Csete, M. E. Efficient gene transfer to pancreatic islets mediated by adenoviral vectors. Transplantation. 59, 263-268 (1995).
- Meng, Z. X. Activation of liver X receptors inhibits pancreatic islet beta cell proliferation through cell cycle arrest. Diabetologia. 52, 125-135 (2009).
- Ronnebaum, S. M. A pyruvate cycling pathway involving cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase regulates glucose-stimulated insulin secretion. J. Biol. Chem. , (2006).
- Milburn, J. L. Pancreatic beta-cells in obesity. Evidence for induction of functional, morphologic, and metabolic abnormalities by increased long chain fatty acids. J. Biol. Chem. 270, 1295-1299 (1995).
- Szot, G., Koudria, P., Bluestone, J. Murine Pancreatic Islet Isolation. J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).
