Aufzählung der wichtigsten peripheren Blut Leukozyten Populationen für Multicenter Clinical Trials mit einem Vollblut Phenotyping Assay
Summary
In diesem Bericht zeigen wir, die Färbung und Analyse Schritte eines Phänotypisierung Assay auf frischem Vollblut durchgeführt, um wichtige angeborenen und adaptiven Leukozytenpopulationen aufzuzählen. Wir betonen, Überlegungen für die Durchführung dieser Verfahren im Rahmen einer multizentrischen klinischen Studie.
Abstract
Kryokonservierung von Leukozyten des peripheren Blutes wird häufig verwendet, um Zellen für die Immunantwort Auswertungen in klinischen Studien erhalten und bietet viele Vorteile für eine einfache und Standardisierung von immunologischen Einschätzungen, aber nachteilige Auswirkungen dieses Prozesses haben auf einigen Zellpopulationen, wie Granulozyten, B-Zellen beobachtet und dendritischen Zellen 1-3. Untersuchung frischen Leukozyten gibt ein genaueres Bild der in vivo Zustand der Zellen, sondern ist oft schwierig, im Rahmen der großen klinischen Studien durchzuführen. Frische Zell-Assays sind abhängig von freiwilligen Verpflichtungen und Fristen und wenn zeitaufwendig, ihre Anwendung kann unpraktisch aufgrund der Arbeitszeiten von Laborpersonal erforderlich. Zusätzlich, wenn Prüfungen in mehreren Zentren durchgeführt, können Labors die Mittel und Ausbildung erforderlich, die Assays durchzuführen, die nicht in ausreichender Nähe zu klinischen Standorten befinden. Um diese Probleme anzugehen, haben wir develwickelt einen 11-farbe Antikörperfärbung Panel, das mit TruCOUNT Röhrchen (Becton Dickinson, San Jose, CA) verwendet werden, um Phänotyp und Auflisten der großen Leukozytenpopulationen im peripheren Blut, wodurch stabilere zelltypspezifisch Informationen als Assays, wie ein komplettes Blutbild (CBC) oder Assays mit kommerziell erhältlichen Platten für TruCOUNT Rohre, die nur für ein paar Zelltypen Flecken entwickelt. Die Färbung ist einfach, erfordert nur 100 ml frisches Vollblut, und dauert etwa 45 Minuten, so dass es möglich ist für Standard-Blut-Verarbeitung Labors durchzuführen. Es ist aus dem BD TruCOUNT Rohr technisches Datenblatt (angepasst Version 8/2010 ). Die Färbung Antikörper-Cocktail können im Voraus in der Masse an einem zentralen Assay Labor hergestellt und versendet die Verarbeitung vor Ort Labors. Stained Rohren befestigt werden kannund eingefroren für den Versand an die zentrale Assay Labor für multicolor Durchflusszytometrie. Die Daten aus dieser Färbung Panel generiert werden verwendet, um Veränderungen in Leukozytenkonzentrationen im Laufe der Zeit in Bezug auf Intervention verfolgen und könnte leicht weiter entwickelt werden, um die Aktivierung Staaten von spezifischen Zelltypen des Interesses zu beurteilen. In diesem Bericht zeigen wir, das Verfahren durch den Blut-Verarbeitung Laboranten zur Färbung von frischem Vollblut und die Schritte, um diese gefärbten Proben an einem zentralen Test-Labor Unterstützung einer multizentrischen klinischen Studie zu analysieren durchzuführen. Die Video-Informationen das Verfahren, wie es im Rahmen einer klinischen Studie Blutentnahme in der HIV Vaccine Trials Network (HVTN) durchgeführt wird.
Protocol
Discussion
In diesem Bericht stellen wir eine Bead-basierte Verfahren zum Aufzählen Leukozytenpopulationen in frischem Vollblut mittels Durchflusszytometrie und decken die notwendigen Parameter für den Einsatz in einer multizentrischen klinischen Studie mit zentraler Probenanalyse. Diese Methode baut auf und optimiert die BD TruCOUNT Protokoll und ermöglicht seinen zuverlässigen Einsatz in einer multizentrischen klinischen Studie. Die Färbung Test ist einfach und dauert etwa 45 Minuten in Anspruch, so dass es möglich ist fü…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Jessica Jones, Erica Clark, Constance Ducar, Donna Smith, Roy Lewis, Lily Apedaile, Joanne Wiesner, Devin Adams, Corey McBain und Stephen Voght für ihre Unterstützung bei der Entwicklung dieser Methode, Manuskript und Video.
Diese Arbeit wurde von der Bill and Melinda Gates Foundation CAVD Zuschuss 38.645 (MJM) und National Institutes of Health Zuschüsse UM1 AI068618 und U01 AI069481 (MJM) unterstützt. EA-N. wird durch NIH Grant T32 AI007140 unterstützt. Wir danken dem James B. Pendleton Charitable Trust für ihre großzügige Ausstattung Spende.
Materials
| Reagent Name | Company | Catalogue number |
| Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 |
| 10X FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 |
| Category B & Exempt Shipping System, Insulated | Saf-T-Pak | STP-320 |
| CD45 AmCyan monoclonal antibody | BD Biosciences | 339192 |
| CD3 FITC monoclonal antibody | BD Biosciences | 349201 |
| CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 341051 |
| CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody | BD Biosciences | 557922 |
| HLA-DR ECD monoclonal antibody | Beckman Coulter | IM3636 |
| CD14 v450 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560349 |
| CD19 PE monoclonal antibody | BD Biosciences | 555413 |
| CD16 APC-H7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560195 |
| CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 335791 |
| CD11c APC monoclonal antibody | BD Biosciences | 559877 |
| CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 551065 |
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