Enumerazione delle popolazioni dei leucociti del sangue periferico per le principali studi clinici multicentrici utilizzando un intero saggio Fenotipizzazione Sangue
Summary
In questo rapporto, dimostriamo la procedura di colorazione e l'analisi di un test di fenotipizzazione effettuato su sangue intero fresco per enumerare le principali popolazioni innata e adattiva dei leucociti. Sottolineiamo considerazioni per l'esecuzione di queste procedure nel contesto di uno studio clinico multicentrico.
Abstract
Crioconservazione dei leucociti del sangue periferico è ampiamente usato per conservare le cellule per la valutazione della risposta immunitaria negli studi clinici e offre molti vantaggi per la facilità e la standardizzazione delle valutazioni immunologiche, ma gli effetti negativi di questo processo sono stati osservati in alcuni sottogruppi di cellule, come i granulociti, cellule B , e cellule dendritiche 1-3. Saggiare leucociti freschi fornisce un quadro più preciso della stato in vivo delle cellule, ma è spesso difficile da eseguire nel contesto di ampi studi clinici. Saggi su cellule fresche sono dipendenti da impegni di volontariato e tempi e, se in termini di tempo, la loro applicazione può essere poco pratico a causa delle ore di lavoro richieste del personale di laboratorio. Inoltre, quando le sperimentazioni sono condotte a molteplici centri, laboratori con le risorse e la formazione necessarie per eseguire i saggi non può essere situato in prossimità sufficiente a siti clinici. Per risolvere questi problemi, abbiamo sviluppatopato un 11-colore del pannello colorazione anticorpo che può essere utilizzato con tubi Trucount (Becton Dickinson, San Jose, CA) e al fenotipo enumerare le popolazioni principali leucociti nel sangue periferico, producendo più robusto tipo cellulare informazioni specifiche di saggi come un emocromocitometrico completo (CBC), o con saggi disponibili in commercio pannelli progettati per tubi Trucount che macchiano solo per alcuni tipi di cellule. La procedura di colorazione è semplice, richiede solo 100 ml di sangue intero fresco, e dura circa 45 minuti, rendendo così possibile la standard di sangue laboratori di trasformazione da eseguire. Si è adattato dal tubo BD scheda tecnica Trucount ( versione 8/2010 ). Il cocktail di anticorpi colorazione può essere preparata in anticipo in massa a un laboratorio saggio centrale e spediti a laboratori di lavorazione del sito. Tubi colorati possono essere fissatie congelati per la spedizione al laboratorio analisi centrale per l'analisi di citometria a flusso multicolore. I dati generati da questo pannello colorazione può essere utilizzato per monitorare variazioni di concentrazione dei leucociti nel tempo in relazione all'intervento e potrebbe facilmente essere ulteriormente sviluppato per valutare gli stati di attivazione di specifici tipi cellulari di interesse. In questo rapporto, dimostriamo la procedura utilizzata dal sangue di elaborazione tecnici di laboratorio per eseguire la colorazione di sangue intero fresco e la procedura per analizzare questi campioni macchiati in un laboratorio analisi centrale di supporto di uno studio clinico multicentrico. I dettagli del video la procedura in quanto viene eseguito nel contesto di un progetto di sperimentazione clinica del sangue nel HIV Vaccine Trials Network (HVTN).
Protocol
Discussion
In questo rapporto, presentiamo una perlina metodo basato per l'enumerazione di popolazioni leucocitarie in sangue fresco intero mediante citometria di flusso e coprire i parametri necessari per il suo utilizzo in uno studio clinico multicentrico, con l'analisi del campione centralizzata. Questo metodo si basa su e ottimizza il protocollo BD Trucount e consente il suo utilizzo affidabile in un ambiente clinico multicentrico. Il saggio colorazione è semplice e richiede circa 45 minuti per eseguire, rendendo cos?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Jessica Jones, Erica Clark, Costanza Ducar, Donna Smith, Roy Lewis, Lily Apedaile, Joanne Wiesner, Devin Adams, Corey McBain e Stephen Voght per la loro assistenza nello sviluppo di questo manoscritto metodo, e video.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Bill e Melinda Gates Foundation CAVD concessione 38645 (MJM) e National Institutes of concede Salute UM1 AI068618 e U01 AI069481 (MJM). EA-N. è sostenuto da NIH Grant T32 AI007140. Ringraziamo il James B. Charitable Trust Pendleton per la loro donazione generoso equipaggiamento.
Materials
| Reagent Name | Company | Catalogue number |
| Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 |
| 10X FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 |
| Category B & Exempt Shipping System, Insulated | Saf-T-Pak | STP-320 |
| CD45 AmCyan monoclonal antibody | BD Biosciences | 339192 |
| CD3 FITC monoclonal antibody | BD Biosciences | 349201 |
| CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 341051 |
| CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody | BD Biosciences | 557922 |
| HLA-DR ECD monoclonal antibody | Beckman Coulter | IM3636 |
| CD14 v450 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560349 |
| CD19 PE monoclonal antibody | BD Biosciences | 555413 |
| CD16 APC-H7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560195 |
| CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 335791 |
| CD11c APC monoclonal antibody | BD Biosciences | 559877 |
| CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 551065 |
References
- Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing. Cryobiology. 27, 269-278 (1990).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories. Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).
- Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure. Blood. 56, 237-245 (1980).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).
- Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D’Avanzo, G., D’Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42, 327-346 (2000).
- Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials. J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).
- Kantor, A. B., Roederer, M., Herzenberg, L., Blackwell, C., Weir, D. . The handbook of Experimental Immunology. 43, 1-49 (1996).
- Hulspas, R. Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates. Cytometry A. 75, 966-972 (2009).
- Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism. Cytometry A. 75, 882-890 (2009).
- Mandy, F., Brando, B. Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6 (2001).
- Vuckovic, S. Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay. J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).
- Lichtner, M. Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response. Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).
- Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram. Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).
