تعداد خلايا الدم البيضاء الكبرى الطرفية بالسكان الدم للمحاكمات متعددة المراكز السريرية باستخدام الدم الكامل الفحص Phenotyping
Summary
في هذا التقرير، إلا أننا شرح الخطوات تلطيخ وتحليل لفحص phenotyping أجريت على الدم الكامل الطازج تعداد السكان الرئيسية الكريات البيض الفطرية والتكيفية. نؤكد اعتبارات لأداء هذه الإجراءات في سياق محاكمة متعددة المراكز السريرية.
Abstract
ويستخدم على نطاق واسع الحفظ بالتبريد من الكريات البيض في الدم المحيطي للحفاظ على خلايا لتقييم الاستجابة المناعية في التجارب السريرية وتوفر العديد من المزايا لسهولة وتوحيد المقررة المناعية، ولكن لوحظت آثار ضارة لهذه العملية على بعض مجموعات فرعية الخلية، مثل المحببة وخلايا B ، والخلايا الجذعية 1-3. يعاير الكريات البيض الطازج يعطي صورة أكثر دقة للدولة في الجسم الحي من الخلايا، ولكن في كثير من الأحيان من الصعب القيام بها في سياق التجارب السريرية الكبيرة. المقايسات الخلية الطازجة تعتمد على الالتزامات المتطوعين والأطر الزمنية، وإذا كان يستغرق وقتا طويلا، يمكن أن يكون تطبيقها غير عملي نظرا لساعات العمل المطلوبة من العاملين في المختبرات. وبالإضافة إلى ذلك، عندما يتم إجراء محاكمات في مراكز متعددة، قد لا المختبرات مع الموارد والتدريب اللازم لأداء فحوصات تكون موجودة على مقربة كافية لمواقع السريرية. لمعالجة هذه القضايا، لدينا جمعةتم تطويرها لتلطيخ الأجسام المضادة 11-لون لوحة التي يمكن استخدامها مع أنابيب Trucount (بيكتون ديكنسون، سان خوسيه، كاليفورنيا) لوالنمط الظاهري تعداد السكان الرئيسية الكريات البيض في الدم المحيطي، مما أسفر عن أكثر قوة من نوع الخلية معلومات محددة من فحوصات مثل عد الدم الكامل (CBC) أو المقايسات المتاحة تجاريا مع لوحات مصممة لأنابيب Trucount أن وصمة عار فقط لأنواع الخلايا قليلة. الإجراء تلطيخ بسيط، يتطلب سوى 100 ميكرولتر من الدم الكامل الطازج، ويستغرق حوالي 45 دقيقة، مما يجعل من الممكن لمعيار الدم تجهيز مختبرات لتنفيذ. أنها مقتبسة من الأنبوب Trucount BD رقة البيانات الفنية ( الإصدار 8/2010 ). ويمكن إعداد كوكتيل الضد تلطيخ مقدما بكميات كبيرة في مختبر الفحص المركزي وشحنها إلى معامل معالجة الموقع. يمكن ان تكون ثابتة أنابيب الملونوجمدت لشحنها إلى المختبر المركزي للفحص تدفق متعدد الألوان التحليل الخلوي. ويمكن استخدام البيانات الناتجة عن هذا الفريق تلطيخ لتعقب التغييرات في تركيزات الكريات البيض مع مرور الوقت فيما يتعلق التدخل ويمكن بسهولة مزيد من التطوير لتقييم الدول تفعيل أنواع معينة من الخلايا في المصالح. في هذا التقرير، علينا أن نبرهن للإجراءات التي استخدمها فنيي المختبرات تجهيز الدم لأداء تلطيخ على الدم الكامل الطازج والخطوات لتحليل هذه العينات في مختبر الملون مقايسة وسط دعم متعددة المراكز السريرية محاكمة. تفاصيل الفيديو الإجراء كما يتم تنفيذ ذلك في سياق محاكمة التعادل الدم السريرية في شبكة لقاح فيروس نقص المناعة البشرية المحاكمات (HVTN).
Protocol
Discussion
في هذا التقرير، نقدم طريقة حبة المستندة إلى تعداد السكان لالكريات البيض في الدم الكامل الطازج بنسبة تغطية التدفق الخلوي والمعلمات الضرورية لاستخدامها في محاكمة متعددة المراكز السريرية مع تحليل عينة مركزية. هذا الأسلوب يعتمد على ويحسن بروتوكول Trucount BD وتمكن استخدام?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جيسيكا جونز، إيريكا كلارك، Ducar كونستانس، دونا سميث، لويس روي، Apedaile ليلى، يزنر جوان، آدمز ديفين، McBain كوري وVoght ستيفن لمساعدتها في تطوير هذه المخطوطة، وطريقة والفيديو.
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة بيل وميليندا غيتس CAVD منحة 38645 (MJM) والمعاهد الوطنية للصحة منح UM1 AI068618 وAI069481 U01 (MJM). EA-N. معتمد من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح T32 AI007140. نشكر الاستئماني جيمس بندلتون B. الخيرية للتبرع السخي من المعدات.
Materials
| Reagent Name | Company | Catalogue number |
| Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 |
| 10X FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 |
| Category B & Exempt Shipping System, Insulated | Saf-T-Pak | STP-320 |
| CD45 AmCyan monoclonal antibody | BD Biosciences | 339192 |
| CD3 FITC monoclonal antibody | BD Biosciences | 349201 |
| CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 341051 |
| CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody | BD Biosciences | 557922 |
| HLA-DR ECD monoclonal antibody | Beckman Coulter | IM3636 |
| CD14 v450 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560349 |
| CD19 PE monoclonal antibody | BD Biosciences | 555413 |
| CD16 APC-H7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560195 |
| CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 335791 |
| CD11c APC monoclonal antibody | BD Biosciences | 559877 |
| CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 551065 |
References
- Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing. Cryobiology. 27, 269-278 (1990).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories. Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).
- Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure. Blood. 56, 237-245 (1980).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).
- Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D’Avanzo, G., D’Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42, 327-346 (2000).
- Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials. J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).
- Kantor, A. B., Roederer, M., Herzenberg, L., Blackwell, C., Weir, D. . The handbook of Experimental Immunology. 43, 1-49 (1996).
- Hulspas, R. Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates. Cytometry A. 75, 966-972 (2009).
- Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism. Cytometry A. 75, 882-890 (2009).
- Mandy, F., Brando, B. Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6 (2001).
- Vuckovic, S. Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay. J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).
- Lichtner, M. Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response. Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).
- Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram. Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).
