Optælling af Major perifert blod leukocytpopulationer for multicenter kliniske undersøgelser med en Whole Blood fænotypebestemmelse Assay
Summary
I denne rapport, viser vi de farvning og analyse trin i en fænotypebestemmelse assay udført på frisk fuldblod til at optælle de store medfødte og adaptive leukocytpopulationer. Vi lægger vægt på overvejelser for disse procedurer udføres i forbindelse med et multicenter klinisk forsøg.
Abstract
Kryopræservering af perifere blodleukocytter er almindeligt anvendt til at bevare celler til immunreaktionsmodificerende i kliniske forsøg og giver mange fordele for nem og standardisering af immunologiske vurderinger, men skadelige virkninger af denne proces er blevet iagttaget nogle celledelmængder, såsom granulocytter, B-celler , og dendritiske celler 1-3. Analyse friske leukocytter giver et mere nøjagtigt billede af in vivo tilstanden af cellerne, men er ofte vanskeligt at udføre i forbindelse med store kliniske forsøg. Friske celleassays er afhængige frivillige forpligtelser og tidsrammer, og hvis tidskrævende, kan deres anvendelse være upraktisk på grund af de arbejdstimer, der kræves af laboratoriepersonale. Hertil kommer, at når der udføres forsøg på flere centre kan laboratorierne med de ressourcer og uddannelse er nødvendige for at udføre de analyser ikke være placeret i tilstrækkelig nærhed til kliniske steder. For at løse disse problemer, har vi udvikletviklet en 11-farve antistoffarvning panel, der kan anvendes med Trucount rør (Becton Dickinson, San Jose, CA) til fænotype og tælle de store leukocytpopulationer i perifert blod, hvilket giver mere robust celletypespecifik information end assays, såsom et komplet blodtælling (CBC) eller assays med kommercielt tilgængelige paneler designet til Trucount rør, der farves for kun et par celletyper. Farvningsproceduren er simpel, kræver kun 100 ul frisk fuldblod, og tager cirka 45 minutter, hvilket gør det muligt for almindelige blod-behandling labs at udføre. Det er tilpasset fra BD Trucount røret Technical Data Sheet ( udgave 8/2010 ). Farvningen antistof cocktail kan fremstilles i forvejen i løs vægt på en central assay laboratorium og sendes til webstedet behandling labs. Farvede rør kan fastsættesog nedfrosset til forsendelse til den centrale assay laboratorium til flerfarvet flowcytometrianalyse. De data, der genereres fra denne farvning panel kan bruges til at spore ændringer i leukocyt koncentrationer over tid i forhold til intervention og let kunne videreudvikles til at vurdere aktivering tilstande af bestemte celletyper af interesse. I denne rapport, viser vi den procedure, der anvendes af blod-behandling laboratorieteknikere til at udføre farvning på frisk fuldblod og de skridt til at analysere disse farvede prøver på et centralt assay laboratorium støtter en multicenter klinisk forsøg. Den video detaljer proceduren, som den udføres i forbindelse med et klinisk forsøg blod uafgjort i HIV Vaccine Trials Network (HVTN).
Protocol
Discussion
I denne rapport præsenterer vi en perle-baseret metode til optælling leukocytpopulationer i frisk fuldblod ved flowcytometri og dække de parametre, der er nødvendige for dens anvendelse i et multicenter klinisk forsøg med centraliseret prøveanalyse. Denne metode bygger på og optimerer BD Trucount protokollen og sætter sin pålidelig brug i et multicenter klinisk forsøg indstilling. Farvningen assay er simpel og tager cirka 45 minutter at udføre, hvilket gør det muligt for blodbehandlingssystemer laboranter ti…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Jessica Jones, Erica Clark, Constance Ducar, Donna Smith, Roy Lewis, Lily Apedaile, Joanne Wiesner, Devin Adams, Corey McBain og Stephen Voght for deres assistance i udviklingen af denne metode, manuskript og video.
Dette arbejde blev støttet af Bill og Melinda Gates Foundation CAVD tilskud 38.645 (MJM) og National Institutes of Health tilskud UM1 AI068618 og U01 AI069481 (MJM). EA-N. understøttes af NIH Grant T32 AI007140. Vi takker James B. Pendleton Charitable Trust for deres generøse udstyr donation.
Materials
| Reagent Name | Company | Catalogue number |
| Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 |
| 10X FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 |
| Category B & Exempt Shipping System, Insulated | Saf-T-Pak | STP-320 |
| CD45 AmCyan monoclonal antibody | BD Biosciences | 339192 |
| CD3 FITC monoclonal antibody | BD Biosciences | 349201 |
| CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 341051 |
| CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody | BD Biosciences | 557922 |
| HLA-DR ECD monoclonal antibody | Beckman Coulter | IM3636 |
| CD14 v450 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560349 |
| CD19 PE monoclonal antibody | BD Biosciences | 555413 |
| CD16 APC-H7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560195 |
| CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 335791 |
| CD11c APC monoclonal antibody | BD Biosciences | 559877 |
| CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 551065 |
References
- Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing. Cryobiology. 27, 269-278 (1990).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories. Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).
- Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure. Blood. 56, 237-245 (1980).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).
- Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D’Avanzo, G., D’Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42, 327-346 (2000).
- Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials. J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).
- Kantor, A. B., Roederer, M., Herzenberg, L., Blackwell, C., Weir, D. . The handbook of Experimental Immunology. 43, 1-49 (1996).
- Hulspas, R. Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates. Cytometry A. 75, 966-972 (2009).
- Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism. Cytometry A. 75, 882-890 (2009).
- Mandy, F., Brando, B. Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6 (2001).
- Vuckovic, S. Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay. J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).
- Lichtner, M. Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response. Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).
- Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram. Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).
