全血の表現型アッセイを用いて多施設臨床試験のための主要な末梢血白血球集団の列挙
Summary
本稿では、大規模な自然免疫と適応白血球集団を列挙するために新鮮な全血で行わ表現型アッセイの染色と分析の手順を紹介します。我々は、多施設臨床試験のコンテキストでこれらの手順を実行する際の考慮事項を強調している。
Abstract
末梢血白血球の凍結保存は、広く臨床試験において免疫応答評価のための細胞を保持するために使用され、免疫学的な評価のしやすさと標準化のための多くの利点を提供していますが、このプロセスの有害な影響は、顆粒球、B細胞などの一部の細胞サブセットで観察されているされている、および樹状細胞1-3。新鮮な白血球をアッセイする細胞の in vivo の状態でのより正確な画像が得られますが、大規模臨床試験のコンテキストで実行することはしばしば困難である。新鮮な細胞アッセイは、時間がかかる場合には、それらのアプリケーションが原因で検査室の職員に求められる労働時間に非現実的なことができ、ボランティアのコミットメントと時間枠に依存していると。また、治験が複数の施設で実施された場合、アッセイを行うために必要なリソースと訓練研究所は臨床現場に十分に近接して配置されていない可能性があります。これらの問題に対処するために、我々は持っている開発表現型と末梢血内に主要な白血球集団を列挙するなど、アッセイよりも堅牢な細胞型に特異的な情報を得る工程; Trucountチューブ（サンノゼ、カリフォルニア州Becton Dickinson）を用いて使用することができる11色の抗体染色パネルをOPED全血球算定（CBC）または少数の細胞型のため染色Trucountチューブ用に設計された市販のパネルとアッセイ。染色手順は簡単ですが、新鮮な全血のみを100μlを必要とし、約45分かかり、それが実現可能な標準的な血液処理ラボが行うようにすること。それは、BD Trucount管技術データシート（から適合さバージョン2010分の8 ）。染色抗体カクテルは、中央アッセイ研究室で一括して事前に準備し、現場での加工ラボに出荷することができます。ステンドチューブを固定することができと多色フローサイトメトリー分析のための中央検査所への出荷のために凍結した。この染色パネルから生成されたデータは、介入との関係で時間をかけて白血球濃度の変化を追跡するために使用することができ、簡単にさらに関心のある特定の種類の細胞の活性化状態を評価するために開発される可能性がある。本稿では、新鮮な全血と多施設臨床試験を支える中心的なアッセイ研究室でこれらの染色されたサンプルを分析するための手順に染色を実行するために血液処理ラボの技術者が使用するプロシージャを示しています。それがHIVワクチン治験ネットワーク（HVTN）における臨床試験採血のコンテキストで実行されるビデオの詳細手順。
Protocol
Discussion
本稿では、フローサイトメトリーによって新鮮全血中の白血球集団を列挙するためのビーズをベースにした方法を提示し、一元的なサンプル分析による多施設臨床試験での使用に必要なパラメータをカバーしています。この方法は、上に構築し、BD Trucountプロトコルを最適化し、多施設臨床試験の設定で、その信頼性の高い使用を可能にします。染色アッセイはシンプルであり、それは血液?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、この方法では、原稿やビデオの開発における彼らの支援のためのジェシカ·ジョーンズ、エリカ·クラーク、コンスタンスDucar、ドナ·スミス、ロイ·ルイス、リリーApedaile、ジョアンウィーズナー、デヴィン·アダムス、コーリー·マクベインとスティーブンVoghtに感謝します。
この作品は、ビル·アンド·メリンダ·ゲイツ財団の助成金CAVD 38645（MJM）と健康の補助金の国立研究所UM1 AI068618とAI069481 U01（MJM）によってサポートされていました。 EA-N。 NIHグラントT32 AI007140によってサポートされています。我々は彼らの寛大な機器の寄付のためにジェームズ·B·ペンドルトン公益信託に感謝します。
Materials
| Reagent Name | Company | Catalogue number |
| Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 |
| 10X FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 |
| Category B & Exempt Shipping System, Insulated | Saf-T-Pak | STP-320 |
| CD45 AmCyan monoclonal antibody | BD Biosciences | 339192 |
| CD3 FITC monoclonal antibody | BD Biosciences | 349201 |
| CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 341051 |
| CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody | BD Biosciences | 557922 |
| HLA-DR ECD monoclonal antibody | Beckman Coulter | IM3636 |
| CD14 v450 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560349 |
| CD19 PE monoclonal antibody | BD Biosciences | 555413 |
| CD16 APC-H7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560195 |
| CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 335791 |
| CD11c APC monoclonal antibody | BD Biosciences | 559877 |
| CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 551065 |
References
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