Telling av Store perifert blod leukocytter populasjoner multisenter kliniske studier med en Fullblod fenotyping Assay
Summary
I denne rapporten viser vi flekker og analyse trinn i en fenotyping analyse utført på fersk hel blod til å nummerere store medfødte og ervervede leukocytter populasjoner. Vi legger vekt på hensynet til å utføre disse prosedyrene i forbindelse med en multisenter klinisk studie.
Abstract
Nedfrysing av perifert blod leukocytter er mye brukt for å bevare celler for immunresponsmodifiserende evalueringer i kliniske studier og har mange fordeler for enkel og standardisering av immunologiske vurderinger, men skadevirkningene av denne prosessen har blitt observert på enkelte celle undergrupper, for eksempel granulocytter, B-celler , og dendrittiske celler 1-3. Analysering ferske leukocytter gir et mer nøyaktig bilde av den in vivo tilstanden av cellene, men er ofte vanskelig å utføre i forbindelse med store kliniske studier. Ferske celle-analyser er avhengig frivillige forpliktelser og tidsrammer og hvis tidkrevende, kan deres anvendelse være upraktisk på grunn av arbeidstiden som kreves for laboratoriepersonell. I tillegg, når forsøkene er utført ved flere sentre, kan laboratoriene med ressurser og opplæring er nødvendig for å utføre analysene ikke være plassert i tilstrekkelig nærhet til kliniske områder. Å løse disse problemene, har vi utvikletviklet en 11-fargers antistoffarging panel som kan brukes med Trucount rør (Becton Dickinson, San Jose, CA) til fenotype og nummererer de store leukocytt populasjoner innenfor perifert blod, gir mer robust celle-type spesifikk informasjon enn analyser som en komplett blodprosent (CBC) eller analyser med kommersielt tilgjengelige paneler designet for Trucount rør som flekken for bare noen få celletyper. Fargingen Fremgangsmåten er enkel, krever kun 100 ul av ferskt fullblod, og tar ca 45 minutter, noe som gjør det mulig for vanlige blod-prosessering laboratorier for å utføre. Den er tilpasset fra BD Trucount tube teknisk datablad ( versjon 8/2010 ). Farging antistoff cocktail kan være forberedt på forhånd i bulk på et sentralt analyse laboratorium og sendes til site behandling laboratorier. Farget rør kan være løstog frosset for forsendelse til den sentrale analysen laboratorium for flerfarget flowcytometri analyse. Dataene generert fra denne farging panelet kan brukes til å spore endringer i leukocytt konsentrasjoner over tid i forhold til inngrep og kan lett bli videreutvikles å vurdere aktiveringsproblemer statene spesifikke celletyper av interesse. I denne rapporten viser vi prosedyren brukes av blod-prosessering lab teknikere til å utføre flekker på fersk hel blod og fremgangsmåten for å analysere disse farget prøvene på et sentralt analyse laboratorium støtter en multisenter klinisk studie. Videoen viser prosedyren som det er utført i sammenheng med en klinisk studie blod uavgjort i HIV-vaksine Trials Network (HVTN).
Protocol
Discussion
I denne rapporten presenterer vi en perle-basert metode for opplisting leukocytter populasjoner i ferskt fullblod med flowcytometri og dekker parametre som er nødvendig for bruk i en multisenter klinisk studie med sentralisert analyse av prøver. Denne metoden bygger på og optimaliserer BD Trucount protokollen og gjør sitt pålitelig bruk i en multisenter kliniske studier. Fargingen analysen er enkel og tar ca 45 minutter å utføre, noe som gjør det mulig for Blodbearbeidingsanlegg laboratorium teknikere utføre de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Jessica Jones, Erica Clark, Constance Ducar, Donna Smith, Roy Lewis, Lily Apedaile, Joanne Wiesner, Devin Adams, Corey McBain og Stephen Voght for deres hjelp i utviklingen av denne metoden, manuskript og video.
Dette arbeidet ble støttet av Bill og Melinda Gates Foundation CAVD stipend 38645 (MJM) og National Institutes of Health tilskudd UM1 AI068618 og U01 AI069481 (MJM). EA-N. støttes av NIH Grant T32 AI007140. Vi takker James B. Pendleton Charitable Trust for deres generøse utstyr donasjon.
Materials
| Reagent Name | Company | Catalogue number |
| Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 |
| 10X FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 |
| Category B & Exempt Shipping System, Insulated | Saf-T-Pak | STP-320 |
| CD45 AmCyan monoclonal antibody | BD Biosciences | 339192 |
| CD3 FITC monoclonal antibody | BD Biosciences | 349201 |
| CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 341051 |
| CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody | BD Biosciences | 557922 |
| HLA-DR ECD monoclonal antibody | Beckman Coulter | IM3636 |
| CD14 v450 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560349 |
| CD19 PE monoclonal antibody | BD Biosciences | 555413 |
| CD16 APC-H7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560195 |
| CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 335791 |
| CD11c APC monoclonal antibody | BD Biosciences | 559877 |
| CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 551065 |
References
- Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing. Cryobiology. 27, 269-278 (1990).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories. Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).
- Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure. Blood. 56, 237-245 (1980).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).
- Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D’Avanzo, G., D’Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42, 327-346 (2000).
- Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials. J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).
- Kantor, A. B., Roederer, M., Herzenberg, L., Blackwell, C., Weir, D. . The handbook of Experimental Immunology. 43, 1-49 (1996).
- Hulspas, R. Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates. Cytometry A. 75, 966-972 (2009).
- Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism. Cytometry A. 75, 882-890 (2009).
- Mandy, F., Brando, B. Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6 (2001).
- Vuckovic, S. Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay. J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).
- Lichtner, M. Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response. Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).
- Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram. Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).
