Enumeração dos principais Populações de Leucócitos do Sangue Periférico de ensaios clínicos multicêntricos usando um ensaio fenotipagem Sangue
Summary
Neste relatório, demonstrar os passos coloração e análise de um ensaio de fenotipagem em sangue total fresco para enumerar grandes inata e adaptativa populações de leucócitos. Ressaltamos considerações para executar estes procedimentos, no contexto de um ensaio clínico multicêntrico.
Abstract
Criopreservação de leucócitos do sangue periférico é amplamente utilizado para preservação de células para a avaliação da resposta imune, em ensaios clínicos, e oferece muitas vantagens para facilidade e normalização das avaliações imunológicos, mas os efeitos prejudiciais deste processo têm sido observados em alguns subconjuntos de células, tais como granulócitos, células B , células dendríticas e 1-3. Ensaio leucócitos frescos dá uma visão mais precisa do estado in vivo das células, mas é muitas vezes difícil de realizar, no contexto de grandes estudos clínicos. Ensaios com células frescas são dependentes de compromissos voluntários e prazos e, se demorado, sua aplicação pode ser impraticável devido às horas de trabalho necessárias do pessoal de laboratório. Além disso, quando os ensaios são realizados em centros múltiplos, laboratórios com os recursos e treinamento necessários para realizar os ensaios não podem estar localizados em proximidade suficiente para locais clínicos. Para resolver estas questões, temos develvolvido um 11-cor do painel de coloração de anticorpo que pode ser utilizado com tubos de Trucount (Becton Dickinson, San Jose, CA) para o fenótipo e enumerar as principais populações de leucócitos no sangue periférico, produzindo mais robusto informação específica do tipo de célula do que os ensaios, tais como um hemograma completo (CBC) ou ensaios com comercialmente disponíveis painéis projetados para tubos Trucount que mancham por apenas alguns poucos tipos de células. O processo de coloração é simples, requer apenas 100 l de sangue total fresco, e leva cerca de 45 minutos, tornando-se viável para o padrão de processamento de sangue laboratórios para executar. É adaptado do tubo Trucount BD ficha técnica ( versão 8/2010 ). O cocktail de anticorpos de coloração pode ser preparada antecipadamente a granel em um laboratório de ensaio central e enviado para o laboratório de processamento no local. Tubos coradas podem ser fixadase congelada para a expedição para o laboratório central para análise multicolor análise de citometria de fluxo. Os dados gerados a partir deste painel de coloração pode ser usado para controlar as alterações nas concentrações de leucócitos ao longo do tempo em relação à intervenção e pode ser facilmente desenvolvidas para avaliar os estados de activação de tipos específicos de células de interesse. Neste relatório, nós demonstrar o procedimento usado pelos técnicos de processamento de sangue de laboratório para realização da coloração de sangue total fresco e os passos para analisar estas amostras coradas em um laboratório de ensaio central de apoio de um ensaio clínico multicêntrico. Os detalhes do procedimento de vídeo, uma vez que é realizada no contexto de um ensaio clínico draw sangue no HIV Vaccine Trials Network (HVTN).
Protocol
Discussion
Neste relatório, apresentamos um método baseado em talão para enumerar populações de leucócitos no sangue total fresco por citometria de fluxo e cobrir os parâmetros necessários para a sua utilização em um ensaio clínico multicêntrico com a análise da amostra centralizado. Este método baseia-se e otimiza o BD protocolo Trucount e permite seu uso confiável em um ambiente de estudo clínico multicêntrico. O método de coloração é simples e leva cerca de 45 minutos para ser realizado, tornando viável pa…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Jessica Jones, Erica Clark, Constance Ducar, Donna Smith, Roy Lewis, Lily Apedaile, Joanne Wiesner, Devin Adams, Corey McBain e Stephen Voght para a sua assistência no desenvolvimento deste método manuscrito, e vídeo.
Este trabalho foi financiado pela Fundação Bill e Melinda Gates CAVD concessão 38.645 (MJM) e do Instituto Nacional de Saúde concede UM1 AI068618 e U01 AI069481 (MJM). EA-N. é suportado pelo NIH Grant T32 AI007140. Agradecemos a confiança James B. Pendleton Charitable por sua doação de equipamentos generoso.
Materials
| Reagent Name | Company | Catalogue number |
| Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 |
| 10X FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 |
| Category B & Exempt Shipping System, Insulated | Saf-T-Pak | STP-320 |
| CD45 AmCyan monoclonal antibody | BD Biosciences | 339192 |
| CD3 FITC monoclonal antibody | BD Biosciences | 349201 |
| CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 341051 |
| CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody | BD Biosciences | 557922 |
| HLA-DR ECD monoclonal antibody | Beckman Coulter | IM3636 |
| CD14 v450 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560349 |
| CD19 PE monoclonal antibody | BD Biosciences | 555413 |
| CD16 APC-H7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560195 |
| CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 335791 |
| CD11c APC monoclonal antibody | BD Biosciences | 559877 |
| CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 551065 |
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