La enumeración de las principales poblaciones de leucocitos de sangre periférica en ensayos clínicos multicéntricos utilizando un ensayo de sangre entera Fenotipado
Summary
En este informe, demuestran los pasos de tinción y análisis de un ensayo de fenotipo realiza en la sangre entera fresca para enumerar las principales poblaciones de leucocitos innatos y adaptativos. Hacemos hincapié en las consideraciones para llevar a cabo estos procedimientos en el contexto de un ensayo clínico multicéntrico.
Abstract
Crioconservación de leucocitos de sangre periférica se utiliza ampliamente para conservar las células para las evaluaciones de la respuesta inmune en los ensayos clínicos y ofrece muchas ventajas para la facilidad y la normalización de las evaluaciones inmunológicas, pero los efectos perjudiciales de este proceso se han observado en algunos subconjuntos de células, tales como los granulocitos, células B , y las células dendríticas 1-3. Ensayo de leucocitos frescas da una imagen más precisa del estado de vivo de las células, pero a menudo es difícil de realizar en el contexto de ensayos clínicos grandes. Los ensayos de células frescas dependen de compromisos voluntarios y los plazos, y si consume tiempo, su aplicación puede ser poco práctico debido a las horas de trabajo necesarias del personal de laboratorio. Además, cuando los ensayos se llevan a cabo en varios centros, laboratorios con los recursos y la capacitación necesarios para llevar a cabo los ensayos no pueden estar situados en la proximidad suficiente a los sitios clínicos. Para abordar estas cuestiones, tenemos que desarrorrollado un panel de anticuerpos 11-tinción de color que se puede utilizar con tubos de Trucount (Becton Dickinson, San Jose, CA) a fenotipo y enumerar las principales poblaciones de leucocitos en la sangre periférica, con un rendimiento más robusto de células de tipo información específica de ensayos tales como un Recuento sanguíneo completo (CSC) o ensayos comercialmente disponibles con paneles diseñados para tubos Trucount que manchan por sólo unos pocos tipos de células. El procedimiento de tinción es simple, requiere sólo 100 l de sangre entera fresca, y tarda aproximadamente 45 minutos, por lo que es factible para el estándar de procesamiento de la sangre para llevar a cabo los laboratorios. Es una adaptación de la hoja BD Trucount tubo técnica de datos ( versión 8/2010 ). El cóctel de anticuerpos de tinción puede ser preparado de antemano a granel en un laboratorio central de ensayo y se envían a los laboratorios de transformación en el lugar. Tubos manchados puede ser fijadoy se congelan para su envío al laboratorio de ensayo central para el análisis multicolor citometría de flujo. Los datos generados a partir de este panel de tinción se puede utilizar para rastrear los cambios en las concentraciones de leucocitos en el tiempo en relación con la intervención y fácilmente podrían ser desarrolladas para evaluar los estados de activación de tipos de células específicas de interés. En este informe, demuestran el procedimiento utilizado por los técnicos de laboratorio de procesamiento de sangre para realizar la tinción de sangre entera fresca y los pasos para analizar estas muestras teñidas en un laboratorio de ensayo de soporte central un ensayo clínico multicéntrico. Los detalles del video del procedimiento, ya que se realiza en el contexto de un proyecto de ensayo clínico de la sangre en la Red de Ensayos de Vacunas contra el VIH (HVTN).
Protocol
Discussion
En este informe se presenta un método basado en perlas para enumerar las poblaciones de leucocitos en sangre entera fresca por citometría de flujo y cubrir los parámetros necesarios para su uso en un ensayo clínico multicéntrico con el análisis de muestras centralizado. Este método se basa en el protocolo y optimiza BD Trucount y permite su uso confiable en un entorno ensayo clínico multicéntrico. El ensayo de tinción es simple y toma aproximadamente 45 minutos para llevar a cabo, por lo que es factible para l…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Jessica Jones, Clark Erica, Ducar Constanza, Donna Smith, Lewis Roy, Apedaile Lily, Wiesner Joanne, Adams Devin, McBain Corey y Voght Stephen por su ayuda en el desarrollo de este método, manuscrito y video.
Este trabajo fue financiado por la Fundación Bill y Melinda Gates CAVD subvención 38.645 (MJM) y los Institutos Nacionales de Salud subvenciones UM1 AI068618 y AI069481 U01 (MJM). EA-N. es apoyado por el NIH subvención T32 AI007140. Damos las gracias a la James B. Pendleton Charitable Trust por su donación generosa equipo.
Materials
| Reagent Name | Company | Catalogue number |
| Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 |
| 10X FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 |
| Category B & Exempt Shipping System, Insulated | Saf-T-Pak | STP-320 |
| CD45 AmCyan monoclonal antibody | BD Biosciences | 339192 |
| CD3 FITC monoclonal antibody | BD Biosciences | 349201 |
| CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 341051 |
| CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody | BD Biosciences | 557922 |
| HLA-DR ECD monoclonal antibody | Beckman Coulter | IM3636 |
| CD14 v450 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560349 |
| CD19 PE monoclonal antibody | BD Biosciences | 555413 |
| CD16 APC-H7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560195 |
| CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 335791 |
| CD11c APC monoclonal antibody | BD Biosciences | 559877 |
| CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 551065 |
References
- Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing. Cryobiology. 27, 269-278 (1990).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories. Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).
- Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure. Blood. 56, 237-245 (1980).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).
- Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D’Avanzo, G., D’Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42, 327-346 (2000).
- Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials. J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).
- Kantor, A. B., Roederer, M., Herzenberg, L., Blackwell, C., Weir, D. . The handbook of Experimental Immunology. 43, 1-49 (1996).
- Hulspas, R. Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates. Cytometry A. 75, 966-972 (2009).
- Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism. Cytometry A. 75, 882-890 (2009).
- Mandy, F., Brando, B. Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6 (2001).
- Vuckovic, S. Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay. J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).
- Lichtner, M. Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response. Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).
- Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram. Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).
