Räkning av Stora perifera populationer blodleukocyt för kliniska multicenterstudier Använda en hel analys Blood Fenotypning
Summary
I denna rapport visar vi färgning och analys steg i en fenotypning analys utförd på färskt helblod att räkna stora medfödda och adaptiva leukocytpopulationer. Vi betonar överväganden för att utföra dessa förfaranden inom ramen för en multicenter klinisk prövning.
Abstract
Frysförvaring av perifert blod leukocyter används flitigt för att bevara celler för immunsvar utvärderingar i kliniska prövningar och erbjuder många fördelar för enkel och standardisering av immunologiska bedömningar, men skadliga effekterna av denna process har observerats på vissa celler undergrupper såsom granulocyter, B-celler , och dendritiska celler 1-3. Analys färska leukocyter ger en mer rättvisande bild av in vivo tillstånd av cellerna, men är ofta svår att genomföra i samband med stora kliniska prövningar. Färska celler analyser är beroende av frivilliga åtaganden och tidsramar och om tidskrävande, kan tillämpningen vara opraktiskt på grund av arbetstiden som krävs av laboratoriepersonal. Dessutom, när prövningar på flera centra, kan laboratorierna med resurser och utbildning som krävs för att utföra analyserna inte placeras i tillräcklig närhet till kliniker. För att ta itu med dessa frågor, har vi utvecklatutvecklat en 11-färgpanelen antikroppsfärgning som kan användas med Trucount rör (Becton Dickinson, San José, CA) till fenotyp och räkna upp de viktigaste leukocytpopulationer inom perifert blod, vilket ger mer robust celltyp specifik information än analyser såsom blodstatus (CBC) eller försök med kommersiellt tillgängliga paneler avsedda för Trucount rör som färgas för bara några celltyper. Färgningsproceduren är enkel, kräver endast 100 pl färskt helblod, och tar cirka 45 minuter, vilket gör det möjligt för vanliga blodbehandlingsapparat laboratorier att utföra. Den är anpassad från BD Trucount röret Technical Data Sheet ( version 8/2010 ). Färgningen antikroppar cocktail kan förberedas i förväg i bulk till ett centralt analys laboratorium och transporteras till labbet webbplatsen bearbetning. Färgade rör kan fästasoch fryses för transport till den centrala analysen laboratorium för multicolor flödescytometrianalys. De data som genereras från denna färgning panelen kan användas för att spåra förändringar i leukocyt koncentrationer över tid i relation till intervention och skulle lätt kunna utvecklas ytterligare för att bedöma aktivering tillstånd av specifika celltyper av intresse. I denna rapport visar vi proceduren som används av blod-labbet tekniker för att utföra färgning på färskt helblod och stegen för att analysera dessa färgade prover på en central analys laboratorium som stöder en multicenter klinisk prövning. Videon detaljerna förfarandet som det utförs i samband med en klinisk prövning blodprovstagning i HIV Vaccine Trials Network (HVTN).
Protocol
Discussion
I denna rapport presenterar vi en pärla-baserad metod för att räkna leukocytpopulationer i färskt helblod med flödescytometri och täcka de parametrar som krävs för dess användning i en multicenter klinisk prövning med centraliserad provanalys. Denna metod bygger på och optimerar BD Trucount protokollet och möjliggör dess tillförlitlig användning i en multicenter klinisk prövning inställning. Färgningen analysen är enkel och tar cirka 45 minuter att utföra, vilket gör det möjligt för blod bearbetni…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Jessica Jones, Erica Clark, Constance Ducar, Donna Smith, Roy Lewis, Lily Apedaile, Joanne Wiesner, Devin Adams, Corey McBain och Stephen Voght för deras hjälp i utvecklingen av denna metod manuskript och video.
Detta arbete stöddes av Bill och Melinda Gates Foundation CAVD bidrag 38.645 (MJM) och National Institutes of Health bidrag UM1 AI068618 och U01 AI069481 (MJM). EA-N. stöds av NIH Grant T32 AI007140. Vi tackar James B. Pendleton Charitable Trust för deras generösa utrustning donation.
Materials
| Reagent Name | Company | Catalogue number |
| Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 |
| 10X FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 |
| Category B & Exempt Shipping System, Insulated | Saf-T-Pak | STP-320 |
| CD45 AmCyan monoclonal antibody | BD Biosciences | 339192 |
| CD3 FITC monoclonal antibody | BD Biosciences | 349201 |
| CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 341051 |
| CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody | BD Biosciences | 557922 |
| HLA-DR ECD monoclonal antibody | Beckman Coulter | IM3636 |
| CD14 v450 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560349 |
| CD19 PE monoclonal antibody | BD Biosciences | 555413 |
| CD16 APC-H7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560195 |
| CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 335791 |
| CD11c APC monoclonal antibody | BD Biosciences | 559877 |
| CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 551065 |
References
- Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing. Cryobiology. 27, 269-278 (1990).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories. Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).
- Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure. Blood. 56, 237-245 (1980).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).
- Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D’Avanzo, G., D’Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42, 327-346 (2000).
- Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials. J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).
- Kantor, A. B., Roederer, M., Herzenberg, L., Blackwell, C., Weir, D. . The handbook of Experimental Immunology. 43, 1-49 (1996).
- Hulspas, R. Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates. Cytometry A. 75, 966-972 (2009).
- Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism. Cytometry A. 75, 882-890 (2009).
- Mandy, F., Brando, B. Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6 (2001).
- Vuckovic, S. Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay. J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).
- Lichtner, M. Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response. Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).
- Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram. Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).
