Schnelle und effiziente Erzeugung von Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem Multititre Platte Format

Summary

Protokolle für die neuronale Differenzierung von pluripotenten menschlichen Stammzellen (hPSCs) sind oft zeitaufwendig und erfordern erhebliche Zellkultur Fähigkeiten. Hier haben wir ein kleines Molekül-basierte Differenzierung Verfahren zu einem multititre Plattenformat angepasst, die eine einfache, schnelle und effiziente Erzeugung von menschlichen Nervenzellen in einer kontrollierten Art und Weise.

Abstract

Bestehenden Protokollen zur Erzeugung von Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) sind oft langwierig, da sie mehrstufige Verfahren, die die Isolierung und Expansion von neuralen Vorläuferzellen, vor terminalen Differenzierung. Im Vergleich zu diesen zeitraubenden Ansätze haben wir kürzlich festgestellt, dass kombinierte Hemmung von drei Signalwege, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 und FGF / ERK, rasche Induktion Neuroektoderms fördert aus hPSCs, durch sofortige Differenzierung in funktionelle Neuronen gefolgt. Hier haben wir unser Verfahren eine neuartige multititre Plattenformat angepasst, den weiteren Ausbau ihrer Reproduzierbarkeit und kompatibel zu machen mit mittel-Throughput-Anwendungen. Es umfasst vier Tagen Neuroektoderms Formation in schwimmenden Kugeln (Embryoid Bodies), um weitere vier Tagen Differenzierung zu Neuronen unter adhärenten Bedingungen. Die meisten Zellen mit diesem Protokoll erhalten scheinen bipolaren sensorischen Neuronen sein. Außerdemdas Verfahren ist sehr leistungsfähig, erfordert keine besondere fachlichen Fähigkeiten, und basiert auf einer einfachen chemisch definierten Medium mit kosteneffizienten niedermolekularen Wirkstoffen. Aufgrund dieser Eigenschaften kann das Verfahren als eine nützliche Plattform für die weitere funktionelle Untersuchungen sowie für zellbasierte Screening-Ansätze erfordern menschlichen sensorischen Neuronen oder Nervenzellen jeglicher Art dienen.

Introduction

hPSCs, bestehend aus Embryonen gewonnenen humanen embryonalen Stammzellen (hES) und induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) sind pluripotent Bedeutung, dass sie sich zu verschiedenen Zelllinien in vitro ^1-2 geben. Zahlreiche differenzierte Zelltypen wurden aus hES-Zellen bisher abgeleitet, unterstützen die Vorstellung, dass diese Zellen wertvolle Werkzeuge für die wissenschaftliche Forschung und zellbasierte Screening-Ansätze zu präsentieren und versprechen für zellbasierte Therapeutika.

Protokolle für neuronale Differenzierung hESCs sind üblicherweise kompliziert und zeitaufwendig, da sie oft beim ersten induzierenden gesamten Neuronalen Schicksal, durch manuelle Trennung von neuralen Vorläuferzellen und anschließender terminaler Differenzierung zu einem gegebenen Neuron interessierenden Art ^3-6 gefolgt basieren. In mancher Hinsicht ist diese Komplexität nicht überraschend und unvermeidlich, daß solche state-of-the-art gerichteten Differenzierung Protokolle schrittweise neigen zu imitieren frühen menschlichen Entwicklung, seit M.h ist in sich außerordentlich komplex. Auf der anderen Seite, kann es zum Teil auch Ausdruck unserer mangelnden Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Prozesse, die sich in der Differenzierung Protokolle, die noch weit davon entfernt, vollständig optimiert.

Im Hinblick auf die Umwandlung von undifferenzierten hPSCs in Neuroektoderms, Pera et al. festgestellt, dass Unterdrückung von BMP / SMAD1/5/8 Signalisierung neuralen Induktion von hESCs ⁷ erhöht. Darüber hinaus hat die Inaktivierung von SMAD2 / 3 Signalisierung gezeigt, Neuroektoderms Formation ⁸ fördern. Dementsprechend neigt kombiniert Inaktivierung dieser beiden Signalwege zu einer effizienteren neuronalen Induktion hPSCs ^4,9 führen. Vor kurzem haben wir gezeigt, dass ein Drittel Signalweg, FGF / ERK als starker Repressor der frühesten Schritte neuroektodermalen Engagement in hESCs dient. Umgekehrt führen gleichzeitiger Unterdrückung von all diesen drei Wegen in der Nähe homogene Umwandlung von hES-Zellen in Neuroektoderms mitin nur vier Tagen ^10. Anschließend wurde hocheffiziente terminalen Differenzierung in funktionale Nervenzellen innerhalb von acht Tagen beobachtet. Die Neuronen erhalten wurden wahrscheinlich sensorischen Neuronen des peripheren Nervensystems, die zum Teil erklären könnte ihre rasche Ableitung ¹⁰ sein. Defekte in sensorischen Neuronen Wartung eine Ursache bestimmter menschlicher Erkrankungen wie familiäre dysautonomia ¹¹ betrachtet. Zur Modellierung solcher Krankheiten auf hiPSC Technologie ¹² basiert, für weitere funktionelle Charakterisierung sowie zur aufgebracht Zwecke nicht erforderlich ist, eine bestimmte Art von Neuronen, kann diese Differenzierung Verfahren stellen eine brauchbare Basis.

Allerdings führte die Differenzierungsstrategie ursprünglich beteiligt Bildung von embryonalen Körper (EBs) von Klumpen von HES Kolonien ¹⁰ eingesetzt, und diese in einem ganz Grad der Heterogenität bezüglich EB Größen und schien auch Neuron Bildung Effizienz in irgendeiner ce kompromittierenll Linien. Darüber hinaus aufgrund der Heterogenität in EB Größen erschien die Fähigkeit, systematisch zu testen Auswirkungen von zusätzlichen Wachstumsfaktoren oder kleine Moleküle während und nach Bildung Neuron etwas verwechselt werden.

In diesem Bericht haben wir unsere bisherigen Verfahren zu einem mittleren Durchsatz-kompatibel, gezwungen, Aggregation-basierte Technik, um EBs in einem sehr size-kontrollierte Weise erzeugen, wie auch in anderen Zusammenhängen ¹³ dargestellt. Anschließend wird die EBs in V-förmige Vertiefungen von 96-Well-Platten wurden mit U-förmigen ultra-low attachment 96-Well-Platten transferiert erzeugt, um Neuroektoderms Formation in Suspension einzuleiten. Vier Tage später konnte die EBs aus was zu ausdifferenzierten Neuronen bei hohem Wirkungsgrad und Homogenität beschichtet werden. Alternativ wurden Tag-4 EBs in einzelne Zellen dissoziiert und als solche, die Folge niedriger Dichte Monoschichten der menschlichen Neuronen überzogen. Coherent Ergebnisse wurden bisher mit zwei unabhängig de erhaltenrived hES-Zelllinien, HuES6 und NCl3.

Als Voraussetzung war erfolgreich EB Bildung strikt abhängig von der Verwendung eines synthetischen Polymer, Polyvinylalkohol (PVA), zusammen mit ROCK Inhibitor Y-27632 bekannten HES Überleben ^13-14 fördern. Als ein Ergebnis gebildet Homogenität der EBs in 96-V-Platten wurde im wesentlichen gegenüber Bildung von EBs als Masse Kulturen auf zufällige Spaltung Techniken verbessert. Dieses System stellt somit eine deutlich verbesserte Plattform für Neuroektoderms Formation in Suspensionskultur, die von hoch kontrollierten Neuron Formation unter adhärenten Bedingungen.

Protocol

Ein. Vorbereitung der Matrigel-beschichteten Platten und Medien Herstellung von Matrigel-beschichteten Platten Matrigel wurde gefunden, ein bevorzugtes Substrat für die Befestigung von differenzierenden EBs sein und fördert auch die effiziente Auswachsen von Neuronen aus diesen 10. Thaw 10 ml Matrigel über Nacht auf Eis. Am nächsten Tag, verdünnen das geleeartige Matrigel mit zwei Volumina eiskaltem DMEM/F-12 und bereiten Aliquots von 1 ml in vorgekühlte 15 ml konischen Rö…

Representative Results

In unserem letzten Bericht im Einklang mit vielen anderen, konnte EBs aus hPSCs einfach durch Replattierung Aggregate auf Routine Aufspaltung hPSCs in Low-attachment Gerichte 10 erzeugt werden. Dies führt in der Regel eine breite Verteilung der resultierenden EB Größen (1C, oben). Ein weiteres Problem, das sich daraus ist, dass EBs in Suspension gehalten, um Aggregation neigen miteinander, was zu einem noch höheren Heterogenität EB Größen. Um diese Probleme zu umgehen, haben wir daher …

Discussion

Die meisten Differenzierungsprotokolle mit EB-Bildung aus hPSCs, einschließlich unserer bereits veröffentlichten Verfahren ^10, auf manuelle oder Enzym-gestützte Ernte hESCs als Aggregate, was unweigerlich zu Heterogenität in EB Größen basieren. Diese Tatsache führt zu Schwankungen in der Differenzierung Effizienz mit einigen Zelllinien, wodurch systematische Untersuchungen schwierig, insbesondere bei einem mittleren Durchsatz Maßstab. Darüber hinaus ist die manuelle Dissektion arbeitsintensive die se…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Matrigel HC	Becton Dickinson	354263	See text for details on handling
DMEM/F-12	Life Technologies	21331-020
Poly(vinyl alcohol)	Sigma	363170	Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks
N2 Supplement	Life Technologies	17502-048	100X, store as frozen aliquots
B27 Supplement	Life Technologies	12587-010	50X, store as frozen aliquots
Bovine Serum Albumin	Sigma	A1595	10% = 500X, store as frozen aliquots
L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin	PAA	P11-013	Or equivalent
FGF2	Peprotech	100-18B	Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots
ROCK inhibitor Y-27632	abcamBiochemicals	Asc-129	Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots
PBS	PAA	H15-002	Or equivalent
Accutase	PAA	L11-007
96-well V-bottom plates	Nunc	277143
PD0325901	Axon Medchem	Axon 1408	Dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots
SB431542	abcamBiochemicals	Asc-163	dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots
Dorsomorphin	Santa Cruz	sc-200689	dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots
96-well U-bottom ultra-low attachment plates	Corning	7007
beta-III Tubulin antibody (mouse)	Sigma	T8660	use at 1:1000
beta-III Tubulin antibody (rabbit)	Covance	PRB-435P	use at 1:2000
BRN3A (POU4F1) antibody	Santa Cruz	sc-8429	use at 1:500
			Table 1. Specific reagents and equipment.