Multititreプレートフォーマットでヒト多能性幹細胞から神経細胞の迅速かつ効率的な生成
Summary
多能性ヒト幹細胞の神経分化（hPSCs）のためのプロトコルは、多くの場合、時間がかかり、実質的な細胞培養のスキルを必要とします。ここでは、制御された方法で人間の神経細胞の、簡便、迅速、かつ効率的に生成できるように、multititreプレートフォーマットへの小分子ベースの分化手順を適応している。
Abstract
ヒト多能性幹細胞（hPSCs）からニューロンを生成するための既存のプロトコルはしばしば彼らが前終末分化に神経前駆細胞の単離および拡張を伴う多段階の手続であるという点で、手間がかかります。これらの時間のかかるアプローチと比較して、我々は最近、3シグナル伝達経路、TGFβ/SMAD2、BMP/SMAD1、およびFGF / ERK、を合わせた抑制が機能して神経細胞への分化即時続いhPSCs、神経外胚葉からの迅速な誘導を促進することを見出した。ここでは、さらに、その再現性を向上させ、半ばスループットのアプリケーションと互換性を持たせるために、小説multititreプレートフォーマットに我々の手順を適応している。それが付着した条件下でのニューロンへの分化の一層の4日間続いフローティング球における外胚葉形成の4日後（胚様体）を含む。このプロトコルを用いて得られたほとんどの細胞は双極感覚ニューロンであるように見えます。また、手順は非常に効率的であり、特定の専門的なスキルを必要とせず、コスト効率の高い小分子との単純な化学的に定義されたメディアに基づいています。これらの特長により、プロシージャは、さらなる機能調査のための有用なプラットフォームとしてだけでなく、どのようなタイプの人間の感覚神経細胞や神経細胞を必要とする細胞ベースのスクリーニングアプローチのための役割を果たすことができる。
Introduction
胚由来のヒト胚性幹細胞（hESC）や人工多能性幹細胞（hiPSCs）を含むhPSCsは、それらがin vitroで1-2の様々な細胞系統を生じさせることができる多能意味です。多数の分化した細胞の種類は、これらの細胞は、科学的研究と細胞ベースのスクリーニングのアプローチのための貴重なツールを紹介し、細胞ベースの治療のための約束を保持するという考えを支持し、現在までにヒトES細胞に由来している。
ヒトES細胞の神経細胞分化プロトコルは、彼らはしばしば神経前駆細胞の分離マニュアル、および利息3-6の与えられたニューロンタイプへのその後の最終分化に続いて、第1誘導全体の神経運命に基づいているため、通常、複雑で時間のかかるものです。いくつかの点では、この複雑さは、このような最先端の指示分化プロトコルを段階的に早い人間開発、whicを模倣する傾向があることを考えれば驚くべき、不可避ではないhはそれ自体が非常に複雑である。その一方で、それは部分的にもはるかに完全に最適化されてからまだ分化プロトコルで、その結果、根本的な分子過程の理解の我々の欠如を反映しているかもしれない。
神経外胚葉への分化hPSCsの変換につきましては、ペラら BMP / SMAD1/5/8シグナル伝達の抑制はhESCの7の神経誘導を増強することを発見した。また、SMAD2 / 3シグナル伝達の不活性化は神経外胚葉の形成8を促進することが示されている。したがって、これら2つの経路の不活性化が組み合わさhPSCs 4,9のより効率的な神経誘導につながる傾向。さらに最近では、我々は第三シグナル伝達経路は、FGF / ERKは、ヒトES細胞における神経外胚葉コミットメントの最も早い段階の強力なリプレッサーとして機能することが示されている。逆に、これらのすべての3つの経路の同時抑圧はと神経外胚葉にhESCの近傍同種の変換につながるわずか4日10インチ続いて、機能的な神経細胞への高い効率的な終末分化は8日以内に観察された。得られたニューロンは、部分的に10彼らの急速な導出を説明するかもしれない末梢神経系の感覚神経細胞である可能性が高かった。感覚ニューロンのメンテナンスの欠陥は、家族性自律神経失調症11などの特定のヒトの疾患の原因を考えられている。ニューロンの特定のタイプを必要としない適用の目的のためだけでなく、さらなる機能解析のために、hiPSC技術12に基づいて、そのような疾患をモデル化するため、この分化の手順では、有用な基礎を提示することができる。
しかし、差別化戦略は、我々は当初のhESCコロニー10の塊から胚体の関与形成（EBS）を採用し、これはEBのサイズに関する異質性のかなり度をもたらし、また、いくつかのCEのニューロン形成効率を損なうように見えたLLライン。また、EBのサイズの異質性に起因して、体系的にニューロン形成中および後に追加の成長因子または小分子の効果をテストする能力がやや混乱しているように見えた。
また、他のコンテキスト13に示すように、本 報告では、我々は非常にサイズ制御された方法でEBを生成するための培地スループット互換、強制集約ベースの技術に我々の前の手順を適応した。続いて、96ウェルプレートのV字型のウェル中に生成されたEBを懸濁液中の神経外胚葉の形成を開始するために、U字型、超低付着の96ウェルプレートに移した。 4日後、EBは、高効率と均一性で分化した神経細胞を生じさせるプレーティングすることができます。あるいは、日-4はEBは、単一細胞に解離し、そのように播種し、人間の神経細胞の低密度の単層で生じた。首尾一貫した結果は、これまで独立して2で得られたデrivedのhESCライン、HuES6とNCL3。
前提条件として、成功したEB形成は一緒hESCの生存13-14を促進することが知られているROCK阻害剤Y-27632で、合成ポリマー、ポリビニルアルコール（PVA）の使用に厳密に依存していた。その結果、96-Vプレートで形成されたEBの均質性は実質的にランダムな分割手法に基づいて大量培養としてEBの形成に比べて強化されました。このシステムは、このように付着した条件の下で高度に制御されたニューロンの形成に続いて懸濁培養における神経外胚葉形成、有意に改善されたプラットフォームを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちの以前に公表されている手順10を含むhPSCs、、からのEB形成を伴う最も分化プロトコルは、手動または必然的にEBのサイズで異質につながる集約などhESCの酵素アシスト収穫に基づいています。この事実は、それによって培地スループットスケールで特に困難な体系的な分析を、レンダリング、いくつかの細胞株を分化効率の変動につながる。さらに、マニュアル解剖自体はスケ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、マックス·プランク協会によって資金を供給された。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. |
References
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