Rask og effektiv produksjon av nerveceller fra menneskelige pluripotente stamceller i en Multititre Plate Format

Summary

Protokoller for neuronal differensiering av pluripotent menneskelige stamceller (hPSCs) er ofte tidkrevende og krever betydelige cellekultur ferdigheter. Her har vi tilpasset et lite molekyl-basert differensiering prosedyren til en multititre plate format, slik at enkel, rask, og effektiv produksjon av humane nevroner på en kontrollert måte.

Abstract

Eksisterende protokoller for generering av nerveceller fra humane pluripotent stamceller (hPSCs) er ofte langtekkelig i at de er flertrinnsoppgaver prosedyrer som involverer isolering og utvidelse av nevrale forløper celler, før til terminal differensiering. I forhold til disse tidkrevende tilnærminger, har vi nylig funnet at kombinerte hemming av tre signalveier, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 og FGF / ERK, fremmer rask induksjon av neuroectoderm fra hPSCs, etterfulgt av umiddelbar differensiering i funksjonelle nerveceller. Her har vi tilpasset vår prosedyre til en roman multititre plate format, for ytterligere å styrke sin reproduserbarhet og å gjøre den kompatibel med mid-gjennomstrømning. Det består av fire dager med neuroectoderm formasjon i flytende kuler (embryoid organer), etterfulgt av ytterligere fire dager med differensiering i nevroner i henhold tilhenger forhold. De fleste celler oppnådd med denne protokollen synes å være bipolare sensoriske nevroner. Videreprosedyren er svært effektiv, krever ikke spesielle spisskompetanse, og er basert på en enkel kjemisk definerte medium med kostnadseffektive små molekyler. På grunn av disse egenskaper kan prosedyren tjene som et nyttig plattform for videre funksjonelle undersøkelser samt for celle-basert screening nærmer krever menneskelige sensoriske nevroner eller nevroner av enhver type.

Introduction

hPSCs, bestående embryo-avledet humane embryonale stamceller (hESCs) og indusert pluripotent stamceller (hiPSCs), er pluripotent betyr at de kan gi opphav til ulike celle linjene i vitro ^1-2. Mange differensierte celletyper er avledet fra hESCs til dags dato, støtter forestillingen om at disse cellene presentere verdifulle verktøy for vitenskapelig forskning og celle-baserte screening tilnærminger, og holder løftet for celle-basert terapi.

Neuronal differensiering protokoller for hESCs er vanligvis komplekse og tidkrevende som de er ofte basert på første inducing samlet nevrale skjebne, etterfulgt av manuell isolering av nevrale stamceller, og påfølgende terminal differensiering inn i en gitt neuron type interesse ^3-6. I noen henseende er denne kompleksiteten ikke overraskende og uunngåelig gitt at en slik state-of-the-art rettet differensiering protokoller tendens til trinnvis etterligne tidlig menneskelig utvikling, hh er i seg selv svært kompleks. På den annen side kan det til dels også reflekterer vår manglende forståelse av de underliggende molekylære prosesser, noe som resulterer i differensiering protokoller som er fortsatt langt fra å bli fullt optimalisert.

Med hensyn til konvertering av udifferensierte hPSCs inn neuroectoderm, Pera et al. fant at undertrykkelse av BMP / SMAD1/5/8 signalering forbedrer nevrale induksjon av hESCs ^7. Videre har inaktivering av SMAD2 / 3 signalering vist seg å fremme neuroectoderm formasjon ^8. Følgelig har en tendens kombinert inaktivering av disse to veier å føre til mer effektiv nevral induksjon av hPSCs ^4,9. Mer nylig har vi vist at en tredje signalveien, serverer FGF / ERK, som en sterk repressor av de tidligste trinn neuroectodermal engasjement i hESCs. Omvendt, samtidig undertrykkelse av alle disse tre veiene fører til nær-homogen konvertering av hESCs inn neuroectoderm medpå bare fire dager ^10. Deretter ble svært effektiv terminal differensiering i funksjonelle nerveceller observert innen åtte dager. Nervecellene som ble målt var sannsynlig å være sensoriske nevroner av det perifere nervesystemet, som kan delvis forklare den raske derivasjon ^10. Defekter i sensorisk neuron vedlikehold regnes en årsak til visse menneskelige lidelser som familiær dysautonomia ^11. For modellering slike sykdommer basert på hiPSC teknikk ^12, for ytterligere funksjonell karakterisering samt for anvendt formål ikke krever noen bestemt type av nevroner, kan denne differensiering prosedyren presentere et nyttig utgangspunkt.

Men resulterte differensieringsstrategi vi opprinnelig ansatt involvert dannelsen av embryonale organer (EBS) fra klumper av hESC kolonier ^10, og dette i ganske grad av heterogenitet om EB størrelser, og også ut til å inngå kompromisser Nevron formasjon effektivitet i noen cell linjer. Videre, på grunn av heterogeniteten i EB størrelser, dukket evnen til systematisk teste effekten av ytterligere vekstfaktorer eller små molekyler under og etter nevron dannelsen å bli noe forvirret.

I denne rapporten, tilpasset vi vår forrige prosedyren til en middels gjennomstrømning-kompatibel, tvunget aggregering-teknikk for å generere EBS i en svært størrelse kontrollert måte, som også vist i andre sammenhenger ^13. Deretter, EBS generert på V-formede brønner av 96-brønners plater ble overført til U-formet ultralav vedlegg 96-brønners plater, for å initiere neuroectoderm formasjonen i suspensjon. Fire dager senere kunne EBS bli belagt ut gi opphav til terminalt differensierte nevroner ved høy effektivitet og homogenitet. Alternativt, var dag-4 EBS dissosiert i enkeltceller og belagt ut som sådan, noe som resulterte i lav tetthet monolayers av menneskelige nerveceller. Sammenhengende resultater ble så langt oppnådd med to uavhengig derived hESC linjer, HuES6 og NCL3.

Som en forutsetning, var vellykket EB formasjon strengt avhengig av bruken av et syntetisk polymer, polyvinylalkohol (PVA), sammen med ROCK inhibitor Y-27632 kjent for å fremme overlevelse hESC ^13-14. Som et resultat, homogenitet i EBS dannet i 96-V-platene ble vesentlig forbedret sammenlignet med dannelsen av EBS som masse kulturer basert på tilfeldige splitting teknikker. Dette systemet tilveiebringer således en betydelig forbedret plattform for neuroectoderm formasjonen i suspensjonskultur, etterfulgt av svært kontrollerte neuron formasjon under adherente betingelser.

Protocol

1. Utarbeidelse av Matrigel-belagte plater og media Fremstilling av Matrigel-belagte plater Matrigel har blitt funnet å være en foretrukket substrat for festing av differensierende EBS og også fremmer effektiv utvekst av nerveceller fra disse 10. Tine 10 ml Matrigel natten på is. Neste dag fortynnes geleaktig Matrigel med to volumdeler iskald DMEM/F-12 og forberede aliquoter av 1 ml i prechilled 15 ml koniske rør som kan lagres frosset ved -20 ° C. Avgjøre hvilke…

Representative Results

I vår forrige rapport, i tråd med mange andre, kan EBS fra hPSCs bli generert ved å replating tilslag ved rutinemessig splitting av hPSCs inn i lav-vedlegg retter 10. Dette resulterer vanligvis i en bred distribusjon av resultat EB størrelser (Figur 1C, øverst). Annet problem resulterer fra dette er at EBS opprettholdt i suspensjon tendens til å aggregere med hverandre, som fører til en enda høyere heterogenitet av EB størrelser. For å omgå disse problemene, vi derfor forsøkt å g…

Discussion

De fleste differensiering protokoller som involverer EB formasjon fra hPSCs, inkludert vår tidligere utgitt prosedyre ^10, er basert på manuell eller enzym-assistert høsting av hESCs som tilslag, som uunngåelig fører til heterogenitet i EB størrelser. Dette faktum fører til variasjon i differensiering effektivitet med noen cellelinjer, og derved gjøre systematiske analyser vanskelig, særlig på et middels gjennomstrømming skala. Videre er manuell disseksjon arbeidskrevende som i seg selv kompromisser…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Matrigel HC	Becton Dickinson	354263	See text for details on handling
DMEM/F-12	Life Technologies	21331-020
Poly(vinyl alcohol)	Sigma	363170	Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks
N2 Supplement	Life Technologies	17502-048	100X, store as frozen aliquots
B27 Supplement	Life Technologies	12587-010	50X, store as frozen aliquots
Bovine Serum Albumin	Sigma	A1595	10% = 500X, store as frozen aliquots
L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin	PAA	P11-013	Or equivalent
FGF2	Peprotech	100-18B	Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots
ROCK inhibitor Y-27632	abcamBiochemicals	Asc-129	Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots
PBS	PAA	H15-002	Or equivalent
Accutase	PAA	L11-007
96-well V-bottom plates	Nunc	277143
PD0325901	Axon Medchem	Axon 1408	Dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots
SB431542	abcamBiochemicals	Asc-163	dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots
Dorsomorphin	Santa Cruz	sc-200689	dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots
96-well U-bottom ultra-low attachment plates	Corning	7007
beta-III Tubulin antibody (mouse)	Sigma	T8660	use at 1:1000
beta-III Tubulin antibody (rabbit)	Covance	PRB-435P	use at 1:2000
BRN3A (POU4F1) antibody	Santa Cruz	sc-8429	use at 1:500
			Table 1. Specific reagents and equipment.