Multititre 판 형식으로 인간 만능의 줄기 세포에서 뉴런의 신속하고 효율적인 생성
Summary
만능 인간 줄기 세포의 neuronal 차별화 (hPSCs)에 대한 프로토콜은 종종 시간이 소요되어 있으며 상당한 세포 배양 기술을 필요로합니다. 여기, 우리는 통제 된 방식으로 인간의 뉴런의 간단 신속하고 효율적인 생성을 허용하는 multititre 판 형식으로 작은 분자 기반의 차별화 절차를 적응하고 있습니다.
Abstract
인간 만능의 줄기 세포 (hPSCs)에서 뉴런의 생성을위한 기존 프로토콜은 종종 이전에 터미널 차별화에 신경 전구체 세포의 분리 및 확장을 포함하는 다단계 절차되기 때문에 지루한 수 있습니다. 이 시간이 많이 소요되는 방식에 비해, 우리는 최근 세 신호 경로, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, 그리고 FGF / ERK의 결합 억제가 작동 뉴런에 즉시 차별화 다음 hPSCs에서 neuroectoderm의 빠른 유도를 촉진하는 것으로 확인되었습니다. 여기, 우리는 더 이상 그 재현성을 향상하고 중간 처리 응용 프로그램과 호환하기 위해, 소설 multititre 판 형식으로 절차를 조정했습니다. 이 자기편 조건에서 뉴런으로 차별화의 다른 사일에 이어 부동 영역 (embryoid 기관)에 neuroectoderm 형성 4 일을 포함한다. 이 프로토콜을 획득 대부분의 세포는 양극성 감각 뉴런 것 같습니다. 또한,절차는 매우 효율적이다 특히 전문적인 기술을 필요로하지 않으며, 비용 효율적인 작은 분자로 간단한 화학적으로 정의 된 매체에 기반을두고 있습니다. 이러한 기능으로 인해, 절차는 더 기능적 조사를위한 유용한 플랫폼으로뿐만 아니라 세포 기반 스크리닝 인간의 감각 뉴런 또는 유형의 뉴런을 요구하는 접근에 사용될 수 있습니다.
Introduction
hPSCs는, 상기 배아를 파생 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)와 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)을, 그들은 체외 1-2에 다양한 세포 lineages을 야기 할 수있는 만능 의미합니다. 수많은 차별화 된 세포 유형은 이러한 세포 연구 및 세포 기반 스크리닝 방법에 대한 유용한 도구를 제시하고, 셀 기반의 치료학에 대한 약속을 보유하는 개념을 지원하는 최신 hESCs에서 파생되었습니다.
그들은 종종 관심을 3-6 주어진 신경 세포 종류에 신경 progenitors의 수동 고립, 그리고 이후의 터미널 차별화에 이어 첫번째 유도 전반적인 신경 운명에 기초로 hESCs에 대한 Neuronal 차별화 프로토콜은 일반적으로 복잡하고 시간이 많이 소요됩니다. 어떤 점에서,이 복잡성은 초기 인간 발달, whic을 모방 등 최첨단의 지시 차별화 프로토콜은 stepwise 경향이 있다는 것을 감안하면 놀라운과 피할 수 없습니다H는 그 자체로 매우 복잡합니다. 한편,이 부분도 지금까지 완전히 최적화되지 여전히 차별화 프로토콜의 결과로, 기본 분자 프로세스에 대한 이해의 부족이 반영 될 수 있습니다.
neuroectoderm, 페라 외에 undifferentiated hPSCs의 전환에 관해서이 있습니다. BMP / SMAD1/5/8 신호의 억제는 hESCs 7 신경 유도를 향상 것으로 나타났습니다. 또한, SMAD2 / 3 신호의 불 활성화는 neuroectoderm 형성 팔을 홍보하기 위해 표시되었습니다. 따라서,이 두 경로의 결합 불 활성화는 hPSCs 4,9을보다 효율적으로 신경 유도로 연결하는 경향이있다. 최근, 우리는이 세 신호 경로는 FGF / ERK는 hESCs의 neuroectodermal의 노력의 초기 단계 강력한 억제 역할을하는 것으로 나타났습니다. 반대로, 모든이 세 경로의 동시 억압이와 neuroectoderm로 hESCs의 거의 균일 전환 될10 단 사일 인치 그 후, 기능 뉴런에 고효율 터미널 차별화은 8 일 이내에 관찰되었다. 획득 뉴런이 부분에서 자신의 빠른 파생 열을 설명 할 수 있습니다 주변 신경계의 감각 뉴런 될 가능성이 있었다. 감각 신경 세포의 유지 보수에 결함이 이러한 가족 dysautonomia 11와 같은 특정 인간의 장애의 원인을 받고 있습니다. 이러한 추가 기능 특성에 대한 hiPSC 기술을 12 일 기준으로 질환,뿐만 아니라 뉴런의 특정 유형을 필요로하지 적용 목적으로 모델링를 들어,이 차별화 절차 유용한 근거를 제시 할 수 있습니다.
그러나, 차별화를 우리가 원래 hESC의 식민지 10 clumps에서 배아 기관의 참여 형성 (EBS)를 고용 전략, 그리고이 EB 크기에 대한 이질성의 꽤 정도의 결과, 또한 일부 CE에 신경 형성의 효율성을 손상 등장붙인다 라인. 또한, EB 크기의 이질성으로 인해 체계적으로 신경 세포 형성 과정과 이후로 추가 성장 요인 또는 작은 분자의 효과를 테스트 할 수있는 능력이 다소 실마리를 못 찾고 할 것처럼 보였다.
이 보고서에서, 우리는 또한 다른 상황 13과 같이 매우 크기 제어 방식으로 EBS를 생성하는 중간 처리량 호환, 강제 집합 기반 기술에 우리의 이전 절차를 적응. 그 후, EBS는 정지 neuroectoderm 형성을 시작하려면, 96 – 웰 플레이트의 V 자형 우물 U 자형 초저 첨부 파일 플레이트 96도로 전송 된에서 생성. 나흘 후, EBS는 높은 효율성과 동질성의 말기 차별화 된 뉴런에 상승을주는 아웃 도금 될 수 있습니다. 또한, 하루 4 EBS는 단일 셀에 dissociated 있었고, 인간의 뉴런의 저밀도 monolayers 결과하는 등의 아웃 도금. 일관된 결과는 지금까지이 독립적으로 드와 함께 얻었다rived hESC 라인, HuES6 및 NCL3.
전제 조건으로 성공적으로 EB 형성 함께 hESC의 생존 13-14을 촉진하는 것으로 알려져 ROCK 억제제 Y-27632과 합성 폴리머, 폴리 비닐 알코올 (PVA)의 사용에 엄격히 의존했다. 그 결과, EBS의 동질성은 96 V-플레이트 년에 설립이 실질적으로 무작위로 분할 기법에 따라 대량 문화 등 EBS의 형성에 비해 향상되었습니다. 이 시스템은 따라서 점착성의 조건 하에서 철저히 통제되고 신경 세포 형성에 이어 서스펜션 문화에 neuroectoderm 형성을위한 대폭 개선 된 플랫폼을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리 이전에 다음 ID로 출판 절차 10을 포함 hPSCs,에서 EB 형성을 포함한 대부분의 차별화 프로토콜은 수동 또는 필연적 EB 크기로 이질성로 연결 집계 등 hESCs의 효소를 이용한 수확을 기반으로합니다. 이 사실은이를 중간 처리량 규모에서, 특히 체계적인 분석이 어려운 렌더링, 일부 세포 라인 차별화 효율의 변화로 연결됩니다. 또한, 수동 해부 자체가 확장 성을 떨어 뜨리고있는 노동 집약…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 최대 플랑크 협회의 지원을받는되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. |
References
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