Snabb och effektiv generering av nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller i en Multititre Plate format
Summary
Protokoll för neuronal differentiering av pluripotenta mänskliga stamceller (hPSCs) är ofta tidsödande och kräver omfattande kunskaper cellodling. Här, har vi anpassat en liten molekyl-baserad differentiering förfarande en multititre plattformat, vilket ger en enkel, snabb och effektiv generering av humana neuroner på ett kontrollerat sätt.
Abstract
Befintliga protokoll för alstring av neuroner från humana pluripotenta stamceller (hPSCs) är ofta tråkiga i att de är flera steg förfaranden involverar isolering och expansion av neurala prekursorceller, före terminal differentiering. I jämförelse med dessa tidskrävande tillvägagångssätt, har vi funnit nyligen att kombinerad hämning av tre signalvägar, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 och FGF / ERK, främjar en snabb induktion av neuroectoderm från hPSCs, följt av omedelbar differentiering till funktionella nervceller. Här har vi anpassat vårt förfarande till en ny multititre platta format för att ytterligare stärka sin reproducerbarhet och att göra den kompatibel med mitten genomströmning applikationer. Den består av fyra dagars neuroectoderm bildas i flytande sfärer (embryoidkroppar), följt av ytterligare fyra dagars differentiering till neuroner enligt vidhäftande förhållanden. De flesta celler erhållna med detta protokoll verkar vara bipolära sensoriska neuroner. Dessutom,förfarandet är mycket effektiv, kräver inte speciella expertkunskaper, och baseras på en enkel kemiskt definierat medium med kostnadseffektiva små molekyler. På grund av dessa funktioner, kan förfarandet utgöra en användbar plattform för vidare funktionell utredning samt för cellbaserad screening närmar kräver mänskliga sensoriska neuroner eller nervceller av något slag.
Introduction
hPSCs bestående embryo-mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) är pluripotenta vilket innebär att de kan ge upphov till olika cellinjer in vitro 1-2. Ett flertal differentierade celltyper har härletts från hESCs hittills, stöder uppfattningen att dessa celler utgör värdefulla verktyg för vetenskaplig forskning och cellbaserade metoder screening, och håll lovande för cellbaserade terapier.
Neuronal differentiering protokoll för hESCs är oftast komplexa och tidskrävande eftersom de ofta bygger på första inducerande övergripande neurala öde, följt av manuell isolering av neurala stamceller och efterföljande terminal differentiering till en viss neuron typ av intresse 3-6. I vissa sammanhang är denna komplexitet inte förvånande och oundviklig med tanke på att en sådan state-of-the-art riktade differentiering protokoll tenderar att stegvis härma människans tidiga utveckling, which är i sig mycket komplicerat. Å andra sidan kan det i en del också spegla vår brist på förståelse för de bakomliggande molekylära processer, vilket resulterar i differentiering protokoll som fortfarande långt ifrån helt optimerad.
När det gäller omvandlingen av odifferentierade hPSCs i neuroectoderm, Pera et al. fann att hämning av BMP / SMAD1/5/8 signalering ökar neural induktion av hESCs 7. Dessutom har inaktivering av SMAD2 / 3 signalering visats främja neuroectoderm bildning 8. Därför tenderar kombinerad inaktivering av dessa två vägar att leda till en effektivare neurala induktion av hPSCs 4,9. På senare tid har vi visat att en tredje signalväg, serverar FGF / ERK, som en stark repressor av de tidigaste stegen i neuroektodermala engagemang i hESCs. Omvänt samtidigt förtryck av alla dessa tre vägar leder till nästan homogent konvertering av hESCs till neuroectoderm medpå bara fyra dagar 10. Därefter var mycket effektiv terminal differentiering till funktionella nervceller observerades inom åtta dagar. De erhållna nervceller var sannolikt sensoriska nervceller i det perifera nervsystemet, vilket kan delvis förklara deras snabba härledning 10. Defekter i sensoriska neuron underhåll betraktas en orsak till vissa humana störningar såsom familjär Dysautonomia 11. För modellering sådana sjukdomar baserade på hiPSC teknik 12, för ytterligare funktionell karakterisering samt för tillämpad ändamål som inte kräver någon särskild typ av nervceller, kan denna differentiering procedur presentera en användbar grund.
Resulterade dock differentiering strategi vi ursprungligen användes inblandade bildning av embryonala organ (EBS) från klumpar av hESC kolonier 10, och detta i en ganska grad av heterogenitet avseende EB storlekar och även verkade kompromissa neuron-bildning effektivitet i vissa cell linjer. Dessutom, på grund av heterogeniteten i EB storlekar föreföll förmåga att systematiskt testa effekterna av ytterligare tillväxtfaktorer eller små molekyler under och efter neuron-bildning vara något skam.
I denna rapport har vi anpassat vår tidigare förfarande till ett medium genomströmning-kompatibel, påtvingad aggregering-baserad teknik för att generera EB i en mycket storlek kontrollerat sätt, vilket också visas i andra sammanhang 13. Därefter EB genereras i V-formade brunnar i 96-brunnars plattor överfördes till U-formade ultralåga fäste 96-brunnars plattor, för att initiera bildning neuroectoderm i suspension. Fyra dagar senare, kunde EBS pläteras ut ger upphov till terminalt differentierade neuroner med hög effektivitet och homogenitet. Alternativt, var dag-4 EB dissocieras till enskilda celler och ströks ut som sådan, vilket resulterade i låg densitet monoskikt av humana neuroner. Sammanhängande resultat hittills erhållits med två oberoende derived hESC linjer, HuES6 och NCL3.
Som en förutsättning, var framgångsrik EB bildning strikt beroende av användningen av en syntetisk polymer, polyvinylalkohol (PVA), tillsammans med ROCK hämmare Y-27.632 känt för att gynna överlevnad hESC 13-14. Som ett resultat, bildad homogenitet EBS i 96-V-plattorna förbättras avsevärt jämfört med bildningen av EBS som massa odlingar baserade på slumpmässiga dela tekniker. Detta system tillhandahåller således en betydligt förbättrad plattform för neuroectoderm bildning i suspensionsodling, följt av höggradigt kontrollerad neuron formation under vidhäftande betingelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
De flesta differentiering protokoll där EB bildning från hPSCs, inklusive vår tidigare publicerade proceduren 10, bygger på manuell eller enzym-assisterad skörd av hESCs som aggregat, vilket oundvikligen leder till heterogenitet i EB storlekar. Detta faktum leder till variationer i differentiering effektivitet med vissa cellinjer, varigenom systematiska analyser svårt, särskilt på ett medium genomströmning skala. Dessutom är manuell dissektion arbetsintensiv som i sig äventyrar skalbarhet.
<p c…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av Max Planck-sällskapet.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brustle, O. A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
- Pera, M. F., et al. Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin. J. Cell Sci. 117, 1269-1280 (2004).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Dev. Biol. 313, 107-117 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Control of early fate decisions in human ES cells by distinct states of TGFbeta pathway activity. Stem Cells Dev. 17, 1065-1077 (2008).
- Greber, B., et al. FGF signalling inhibits neural induction in human embryonic stem cells. EMBO J. 30, 4874-4884 (2011).
- Anderson, S. L., et al. Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene. Am. J. Hum. Genet. 68, 753-758 (2001).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
