Selectieve vangen van 5-hydroxymethylcytosine van genomisch DNA

Summary

Beschreven is een twee stappen proces labeling met β-glucosyltransferase (β-GT) een azide-glucose dragen aan 5-HMC, gevolgd door een klik chemie biotine linker gemakkelijk en dichtheid onafhankelijk verrijking brengen. Deze efficiënte en specifieke etiketteringsvoorschriften methode maakt het mogelijk verrijking van 5-HMC met extreem lage achtergrond en high-throughput epigenomisch mapping vinden plaats via next-generation sequencing.

Abstract

5-methylcytosine (5-mC) vormt ~ 2-8% van de totale cytosines in menselijk genomisch DNA en beïnvloedt een breed scala aan biologische functies, inclusief genexpressie, het behoud van de integriteit genoom, ouderlijke imprinting, X-chromosoom inactivatie, regulering van ontwikkeling, de vergrijzing, en kanker ^1. Onlangs werd de aanwezigheid van een geoxideerd 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (HMC 5), ontdekt in zoogdiercellen, met name in embryonale stam (ES) cellen en neuronale cellen ^2-4. 5-HMC wordt gegenereerd door oxidatie van 5-mC gekatalyseerd door TET familie ijzer (II) / α-ketoglutaraat afhankelijke dioxygenases ^{2, 3.} 5-HMC voorgesteld worden met het onderhoud van embryonale stamcellen (MES) cel, normale hematopoiese en maligniteiten en zygote ontwikkeling ^{2, 5-10.} Om beter te begrijpen van de functie van 5-HMC, een betrouwbare en eenvoudig sequencing is essentieel. Traditionele bisulfiet sequencing kunnen geen onderscheid maken 5-HMC van 5-MC ¹¹ </sup>. Om de biologie van 5-HMC te ontrafelen, hebben we een zeer efficiënte en selectieve chemische benadering van labelen en vast te leggen 5-HMC, gebruik te maken van een bacteriofaag enzym dat een glucose-eenheid draagt ​​bij aan 5-HMC specifiek ^12.

Hier beschrijven we een eenvoudige twee stappen voor selectieve chemische labeling van 5-HMC. In de eerste stap labeling wordt 5-HMC in genomisch DNA gelabeld met een 6-azide-glucose gekatalyseerd door β-GT, een glucosyltransferase van T4 bacteriofaag, op een manier die de 6-azide-glucose overdraagt ​​aan HMC 5 van de gemodificeerde cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In de tweede stap biotinylering wordt een disulfide linker biotine aan de azidegroep door klikken chemie. Beide stappen zijn zeer specifiek en efficiënt, waardoor Uitgebreide beschrijving ongeacht de overvloed van 5-HMC in genoomgebieden en geeft zeer lage achtergrond. Na biotinylering van 5-HMC, de 5-HMC bevattende DNA-fragmenten worden vervolgens selectief gevangenmet streptavidine beads in een dichtheid-onafhankelijke manier. De resulterende 5-HMC verrijkte DNA-fragmenten kunnen worden gebruikt voor downstream analyses, met inbegrip volgende generatie sequencing.

Onze selectieve etikettering en capture-protocol verleent een hoge gevoeligheid, van toepassing zijn op elke bron van genomisch DNA met een variabele / diverse 5-HMC abundanties. Hoewel het belangrijkste doel van dit protocol is de downstream toepassing (dat wil zeggen., Next-generation sequencing in kaart te brengen van de 5-HMC distributie in genoom), het is compatibel met single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, dat is kan leveren single-basisresolutie sequencing van 5-HMC.

Protocol

1. Genomisch DNA Fragmentation Fragment genomisch DNA met sonificatie om een ​​gewenst groottebereik geschikt voor genoomwijde sequencing platform. (We meestal ultrasone trillingen ~ 300 bp.) Controleer de grootteverdeling van de gefragmenteerde genomisch DNA op 1% agarose gel (figuur 1). 2. DNA Bereiding Bepaal het uitgangs-DNA bedragen op basis van de overvloed van 5-HMC in genomisch DNA. Aangezien 5-HMC niveaus var…

Discussion

5-hydroxymethylcytosine (HMC 5) is een recent geïdentificeerde epigenetische modificatie in aanzienlijke hoeveelheden in bepaalde types zoogdiercel. De methode die hier wordt gepresenteerd voor het bepalen van het genoom-brede distributie van 5-HMC. We gebruiken T4 bacteriofaag β-glucosyltransferase een gemanipuleerde glucose rest met een azidegroep op de hydroxylgroep van 5-HMC brengen. De azidegroep kan chemisch worden gemodificeerd met biotine voor de detectie, affiniteitsverrijking en sequencing van 5-HMC bevatten…

Materials

Name	Company	Catalog #	Comment
			Reagents
5M Sodium chloride (NaCl)	Promega	V4221
0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Promega	V4231
1M Trizma base (Tris) pH7.5	Invitrogen	15567-027)
HEPES 1M, pH7.4	Invitrogen	15630
Magnesium chloride (MgCl2) 1M	Ambion	AM9530G
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418
Tween 20	Fisher BioReagents	BP337-100
DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate	Click Chemistry Tools	A112P3
1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure	Invitrogen	15508-013
QIAquick Nucleotide Removal Kit	Qiagen	28304
Micro Bio-Spin 6 Column	Bio-Rad	732-6222
Dynabeads MyOne	Invitrogen	650-01
Streptavidin C1
Qiagen MinElute PCR Purification Kit	Qiagen	28004
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500500
UDP-6-N3-glucose	Active Motif	55013
			Enzyme
β-glucosyltransferase (β-GT)	New England Biolab	M0357
			Equipment
Sonication device	Covaris
Desktop centrifuge
Water bath	Fisher Scientific
Gel running apparatus	Bio-Rad
NanoDrop1000	Thermo Scientific
Labquake Tube Shaker	Barnstead
Labquake Tube Shaker	Thermolyne
Magnetic Separation Stand	Promega	Z5342
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen
			Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20).