Genomik DNA 5-hydroxymethylcytosine seçici Yakalama
Summary
Açıklanan kolay ve yoğunluk bağımsız zenginleştirme için bir biyotin bağlayıcının aktarmak tıkırtı kimya ve ardından, 5-HMC için bir azit-glikoz aktarmak için β-glukoziltransferaz (β-GT) ile iki aşamalı bir etiketleme bir işlemdir. Bu etkili ve spesifik bir etiketleme yöntemi nesil dizileme ile son derece düşük arka plan ve yüksek verimlilik epigenomic haritalama ile 5-HMC zenginleşmesine olanak sağlar.
Abstract
5-metilsitozin (5-mC) insan genomik DNA'daki toplam sitozinler arasında ~% 2-8 oluşturan ve gen ekspresyonu, genom bütünlüğünün korunması, ebeveyn baskılama, X kromozomu inaktivasyonu, düzenlenmesi de dahil olmak üzere biyolojik fonksiyonları, geniş bir yelpazede etkiler gelişme, yaşlanma ve kanser 1. Son zamanlarda, bir okside 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), varlığında embriyonik sap (ES) hücreleri ve nöronal hücreler 2-4, özellikle de memeli hücrelerinde tespit edilmiştir. 5-HMC TET aile demir (II) / α-ketoglutarat-bağımlı dioxygenases 2, 3 ile 5-mC katalizli oksitlenmesi ile elde edilir. 5-HMC embriyonik kök (MES) hücre normal hemopoeziste ve maligniteler ve zigot gelişimi 2, 5-10 bakımı dahil olmak üzere önerilmiştir. Iyi 5-HMC fonksiyonunu anlamak için, güvenilir ve kolay sıralama sistemi esastır. Geleneksel bisülfit dizileme 5-mC 11 5-HMC ayırt edemez </sup>. 5-HMC biyolojisini aydınlatma için, özellikle 5-HMC 12 glikoz parçası ekler bir bakteriyofaj enzim yararlanarak, etiketlemek ve 5-HMC yakalamak için oldukça etkili ve seçici kimyasal bir yaklaşım geliştirdik.
Burada 5-HMC seçici kimyasal etiketleme için basit bir iki aşamalı bir prosedür açıklanmaktadır. Birinci adımda etiketleme, genomik DNA 5-HMC 5-HMC için 6-azit-glikoz aktaran bir şekilde, β-GT, T4 bakteriyofaj bir glukoziltransferaz ile bir 6-azit-glikoz katalize ile etiketlenir Modifiye kofaktör, UDP-6-N3-GLC (6-N3UDPG). İkinci adımda, biyotinilasyon, bir disülfid biyotin linker klik kimyası ile azid grubu eklenir. Iki adım genomik bölgelerde 5-HMC bolluğu bakılmaksızın etiketlenmesi ve son derece düşük arka plan vererek tamamlamak için lider, son derece spesifik ve etkili. 5-HMC takibi biyotinilasyon, 5-HMC içeren DNA parçaları daha sonra seçici yakalanırbir yoğunluk-bağımsız bir şekilde streptavidin boncuklar kullanarak. Sonuçta ortaya çıkan 5-HMC-zenginleştirilmiş DNA fragmanları, yeni nesil dizi analizi de dahil olmak üzere aşağı akım analizleri için kullanılabilir.
Bizim seçici etiketleme ve yakalama protokol çeşitli / değişken 5-HMC bolluğu ile genomik DNA herhangi bir kaynak için geçerli yüksek hassasiyet, bahşeder. Bu protokolün amacı ve mansabındaki uygulaması (yani., Yeni nesil dizileme genomunda 5-HMC dağıtım haritaya) olsa da, tek-molekül, bir gerçek zamanlı SMRT (DNA) dizi ile uyumlu 5-HMC tek-baz çözünürlük sıralama sunma yeteneğine.
Protocol
Discussion
Hydroxymethylcytosine 5-(5-HMC) belirli memeli hücre türleri içinde önemli miktarda yeni tanımlanmış bir epigenetik modifikasyon mevcuttur. Burada sunulan yöntem, 5-HMC arasında genom dağılımı belirlemek içindir. Biz 5-HMC bir hidroksil grubu üzerine bir azid grubu ihtiva eden bir mühendislik glikoz yarımı aktarmak için β-glukoziltransferaz T4 bakteriyofaj kullanır. Azid grubu kimyasal memeli genomları 5-HMC içeren DNA parçalarının tespiti, afinite zenginleştirme ve sıralama için biotin ile …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (CH ve NS051630/MH076090/MH078972 için PJ için GM071440) tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog # | Comment |
| Reagents | |||
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Promega | V4221 | |
| 0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | V4231 | |
| 1M Trizma base (Tris) pH7.5 | Invitrogen | 15567-027) | |
| HEPES 1M, pH7.4 | Invitrogen | 15630 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) 1M | Ambion | AM9530G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | |
| DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate | Click Chemistry Tools | A112P3 | |
| 1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure | Invitrogen | 15508-013 | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Micro Bio-Spin 6 Column | Bio-Rad | 732-6222 | |
| Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
| Streptavidin C1 | |||
| Qiagen MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| UDP-6-N3-glucose | Active Motif | 55013 | |
| Enzyme | |||
| β-glucosyltransferase (β-GT) | New England Biolab | M0357 | |
| Equipment | |||
| Sonication device | Covaris | ||
| Desktop centrifuge | |||
| Water bath | Fisher Scientific | ||
| Gel running apparatus | Bio-Rad | ||
| NanoDrop1000 | Thermo Scientific | ||
| Labquake Tube Shaker | Barnstead | ||
| Labquake Tube Shaker | Thermolyne | ||
| Magnetic Separation Stand | Promega | Z5342 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20). |
References
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. , 245-254 (2003).
- Ito, S. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466, 1129-1133 (2010).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
- Ko, M. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Koh, K. P. Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).
- Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).
- Wossidlo, M. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nat. Commun. 2, 241 (2011).
- Gu, T. P. The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes. Nature. 477, 606-610 (2011).
- Dawlaty, M. M. Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development. Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).
- Huang, Y. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One. 5, e8888 (2010).
- Song, C. X. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).
- Pastor, W. A. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473, 394-397 (2011).
- Matarese, F., Pau, C. a. r. r. i. l. l. o. -. d. e. S. a. n. t. a., E, ., Stunnenberg, H. G. 5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block. Mol. Syst. Biol. 7, 562 (2011).
- Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, 181 (2010).
- Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. Biochemical characterization of recombinant β-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes. Biochemistry. , (2012).
- Rusmintratip, V., Sowers, L. C. An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).
- Globisch, D. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
- Yildirim, O. Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells. Cell. 147, 1498-1510 (2011).
- Szulwach, K. E. Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells. PLoS Genet. 7, e1002154 (2011).
- Szulwach, K. E. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).
