ゲノムDNAから5 - ヒドロキシの選択的捕獲
Summary
説明は簡単で、密度に依存しない濃縮のためのビオチンリンカーを転送するために、クリックケミストリー、続いて5-HMCにアジド-グルコースを転送するために、β-グルコシルトランスフェラーゼ（β-GT）を用いた二段階ラベリングプロセスである。この効率的で特異的標識法は、次世代シーケンシングを介して非常に低いバックグラウンドと高いスループットepigenomicマッピングで5-HMCの濃縮を可能にします。
Abstract
5 – メチルシトシン（5-MC）は、ヒトのゲノムDNAの総シトシン〜2から8パーセントを構成しており、遺伝子発現、ゲノムの完全性の維持、親の刷り込み、X染色体不活性化の調節を含む生物学的機能の広い範囲に影響を与え発達、老化、癌1。最近では、酸化された5-MC、5 -ヒドロキシメチル（5 – HMC）の存在は、胚性幹（ES）細胞および神経細胞2-4の、特に哺乳動物細胞内で発見されました。 5-HMCは、TETファミリー鉄（II）/α-ケトグルタル酸依存オキシゲナーゼ2、3、5-MC触媒作用の酸化によって生成されます。 5-HMCは胚性幹（MES）細胞、正常な造血及び悪性腫瘍、および受精卵開発2、5月10日の維持に関与することが提案されている。良い5-HMCの機能を理解するために、信頼性が高く、簡単なシーケンシングシステムが不可欠です。従来のバイサルファイトシークエンシングは5-MC 11から5-HMCを区別することはできません</sup>。 5-HMCの生態を解明するために、我々は具体的には5-HMCに12グルコース部分を追加したバクテリオファージ酵素を利用して、ラベルと5-HMCをキャプチャするための非常に効率的かつ選択的な化学的なアプローチを開発しました。
ここでは5-HMCの選択的化学標識するための簡単な2ステップの手順を説明します。第一の標識のステップでは、ゲノムDNA中の5 – HMCは、5 – HMCに6 – アジド-グルコースを転送する方法では、β-GTは、バクテリオファージT4からグルコシルトランスフェラーゼによる6 – アジド-グルコースで触媒で標識されている修正された補因子は、UDP-6-N3-GLC（6 N3UDPG）。第二段階、ビオチン化では、ジスルフィドビオチンリンカーをクリックケミストリーによりアジド基に装着されている。両方の手順は、ゲノム領域における5-HMCの豊富さに関わらず、ラベリングと非常に低いバックグラウンドを与えて完成につながる、非常に特異的かつ効率的である。 5-HMCのビオチン化に続いて、5-HMCを含むDNA断片を選択的に捕獲される密度に依存しない方法でストレプトアビジンビーズを使用。得られた5-HMC-濃縮したDNA断片を、次世代シーケンシングを含む下流の分析、を使用することができる。
私たちの選択的標識とキャプチャプロトコルは、変数/多様な5-HMCの存在量を用いたゲノムDNAの任意のソースに適用し、高感度を与える。このプロトコルの主な目的は、その下流のアプリケーション（ すなわち 。、次世代シーケンシングは、ゲノム中の5-HMC分布をマップアウトする）ですが、それは単一分子であり、リアルタイムSMRT（DNA）の配列決定、と互換性があります5-HMCの単一塩基解像度のシーケンシングを提供することができる。
Protocol
Discussion
5 – ヒドロキシメチル（5 – HMC）は、特定の哺乳類の細胞型における実質的な量で最近同定されたエピジェネティックな修飾の存在しています。ここで紹介する方法は、5 – HMCのゲノムワイドな分布を決定するためのものです。我々は5-HMCのヒドロキシル基にアジド基を含有する人工グルコース部分を転送するために、β-グルコシルT4バクテリオファージを使用しています。アジド基を化学的…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国国立衛生研究所（CHとNS051630/MH076090/MH078972にPJにGM071440）によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog # | Comment |
| Reagents | |||
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Promega | V4221 | |
| 0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | V4231 | |
| 1M Trizma base (Tris) pH7.5 | Invitrogen | 15567-027) | |
| HEPES 1M, pH7.4 | Invitrogen | 15630 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) 1M | Ambion | AM9530G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | |
| DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate | Click Chemistry Tools | A112P3 | |
| 1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure | Invitrogen | 15508-013 | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Micro Bio-Spin 6 Column | Bio-Rad | 732-6222 | |
| Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
| Streptavidin C1 | |||
| Qiagen MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| UDP-6-N3-glucose | Active Motif | 55013 | |
| Enzyme | |||
| β-glucosyltransferase (β-GT) | New England Biolab | M0357 | |
| Equipment | |||
| Sonication device | Covaris | ||
| Desktop centrifuge | |||
| Water bath | Fisher Scientific | ||
| Gel running apparatus | Bio-Rad | ||
| NanoDrop1000 | Thermo Scientific | ||
| Labquake Tube Shaker | Barnstead | ||
| Labquake Tube Shaker | Thermolyne | ||
| Magnetic Separation Stand | Promega | Z5342 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20). |
References
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. , 245-254 (2003).
- Ito, S. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466, 1129-1133 (2010).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
- Ko, M. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Koh, K. P. Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).
- Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).
- Wossidlo, M. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nat. Commun. 2, 241 (2011).
- Gu, T. P. The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes. Nature. 477, 606-610 (2011).
- Dawlaty, M. M. Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development. Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).
- Huang, Y. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One. 5, e8888 (2010).
- Song, C. X. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).
- Pastor, W. A. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473, 394-397 (2011).
- Matarese, F., Pau, C. a. r. r. i. l. l. o. -. d. e. S. a. n. t. a., E, ., Stunnenberg, H. G. 5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block. Mol. Syst. Biol. 7, 562 (2011).
- Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, 181 (2010).
- Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. Biochemical characterization of recombinant β-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes. Biochemistry. , (2012).
- Rusmintratip, V., Sowers, L. C. An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).
- Globisch, D. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
- Yildirim, O. Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells. Cell. 147, 1498-1510 (2011).
- Szulwach, K. E. Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells. PLoS Genet. 7, e1002154 (2011).
- Szulwach, K. E. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).
