マウス大脳皮質アストロサイトの単離および培養
Summary
アストロサイトは、脳の正常な発達と機能、および中枢神経系の修復に欠かせない基本的な生物学的プロセスに参加して多目的な細胞であると認識されてきた。ここでは、中枢神経系細胞のこの主要なクラスの生物学を研究するために純粋なマウスアストロサイトの培養液を得るための迅速な方法を提示します。
Abstract
アストロサイトは、哺乳類の脳に豊富に細胞型で、まだ多くのそれらの分子的および機能的特性について学んだことが残っている。 体外アストロサイト細胞培養系では詳細にこれらのグリア細胞の生物学的機能を研究するために使用することができます。このビデオプロトコルは仔マウスの混合皮質細胞の単離および培養により純粋アストロサイトを取得する方法を示します。法は生存ニューロンの欠如およびアストロサイト、オリゴデンドロサイトおよびミクログリア、文化の中枢神経系の3つの主要なグリア細胞集団の分離に基づいています。文化の最初の日中に代表的な画像は、混合細胞集団が存在することを実証し、アストロサイトがコンフルエントになるとミクログリア、オリゴデンドロサイトから分離する必要があるとき、時点を示しています。また、純度と十分に確立されたために免疫組織化学染色を用いて培養アストロサイトのアストロサイトの形態を示し、新たにアストロサイトのマーカーを説明した。この培養系は簡単に星状膠細胞生物学の様々な側面を研究するための純粋なマウスのアストロサイトおよびアストロサイト馴化培地を取得するために使用できます。
Introduction
アストロサイトは、中枢神経系（CNS）において非常に豊富な細胞型である。人間の大脳皮質のニューロン1あたり1.4アストロサイトが存在するのに対し、ニューロンへのアストロサイトの比率は、マウスおよびラットの大脳皮質で1:3である。アストロサイト機能に興味は近年劇的に増加している。アストロサイトの主な機能は、ニューロン2,3に構造的および代謝のサポートを提供する上で自らの役割である。アストロサイトのための新たに発見された役割は、機能の広いスペクトルをカバーしています。これらは、開発4月6日の間に開発の軸索と特定の神経芽細胞の遊走を誘導、シナプス伝達関数、神経回路7から9によるシナプス強度と情報処理、血液脳関門における役割（BBB）の形成10と整合性11月13日を含む脳血管トーン14と規制。アストロサイトのもう一つの大きな特徴は、傷害への応答です。 astrocyt病的条件下でES反応となり、さらに中間フィラメントグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）と抑制性細胞外マトリックス（ECM）タンパク質15,16の発現をアップレギュレートする。反応性アストロサイトは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）家族のアストロ分泌ECMタンパク質、CNS損傷15から17の後に軸索の再生を阻害する主要な要因の主に構成されていますグリア瘢痕を形成することによって、健康な組織から損傷部位の境界を定める。
アストロサイトは後期胚発生および出生後の早い時期に放射状グリア（RG）の細胞に由来する。アストロサイトの仕様が発生した後、アストロサイト前駆体は、彼らは終末分化のプロセスを開始し、最終的な位置に移動する。 生体内では 、アストロサイトは彼らの典型的な形態18,19によって示されるように3〜4週間、出生後成熟したように見える。 RGの細胞の亜集団は、脳室下帯のアストロサイト（タイプB細胞）に変換します。 BOTH、RGとB型細胞はそれぞれ、開発中および成人におけるアストロサイトのような神経幹細胞（NSC）として機能します。アストロサイトと同様に、RGとB型細胞はまた、これらのマーカーはもっぱら特に成人星状膠細胞を標識するために使用できないことを示す、アストロサイト特異的グルタミン酸トランスポーター（GLAST）、脳脂質結合タンパク質（BLBP）、およびGFAPを発現している。健康な脳、RGとB型細胞では分裂しない大人実質アストロサイトとは対照的に、自己再生する能力のような幹細胞の可能性を示す。アストロサイトの異常は、アルツハイマー病20,21、ハンチントン病22、パーキンソン病23、レット症候群24とアレキサンダー病25を含む、数多くの病態に関与している。また、アストロサイトはアストロサイトの活性化とアストログリア瘢痕形成16,26につながる、CNSのすべての侮辱に反応します。以下の脳trを形成アストロサイトグリア瘢痕アウマまたは脊髄損傷は、神経再生15を防止プライム障壁であると考えられている。
細胞の精製された集団を分離し、維持するための信頼できる方法の開発は、神経系の我々の理解に不可欠となっています。マッカーシーとde Vellisによる先駆的な仕事は、新生児ラット組織27からアストロサイトのほぼ純粋な培養物を調製するためにこれまでに研究者を可能にします。多くはマウス大脳皮質アストロサイトを単離するためのわずかに修正された形でここに提示され、この方法を用いて、星状膠細胞生物学を学んだされています。 in vivo試験、アストロサイトと同様にin vitro培養で説明を使用して得られた馴化培地中で補完して、アストロサイト機能にさらなるゲイン洞察に貴重なツールです。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここに概説された方法は、もともと1980年に27マッカーシーとde Vellisによって記述げっ歯新生児の脳からアストロサイトの培養準備に基づいています。生後P1からP4をマウス脳に皮質星状膠細胞の分離と培養の変法は速いここに提示された、純粋な一次星状膠細胞を生み出す、再現性の高いです。この手法は、簡単にこのようなラットやブタ由来や脊髄などの他の脳領域からなどの他の?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
1442キロバイトと欧州委員会のFP7のグラントPIRG08-GA-2010から276989、NEUREX、そしてドイツ研究財団助成SCHAにSS、教育研究連邦省（BMBF 01 EO 0803）にFazit財団大学院フェローシップでサポートされている/ CS 3-1〜著者らは相反する経済的利益を持っていません。
Materials
| Name of working solution | Company | Catalogue number | Final concentration |
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 31966-021 | |
| FBS, heat-inactivated | Life Technologies | 10082-147 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration: 1% |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 2.5% Trypsin | Life Technologies | 15090-046 | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | 50 μg/ml |
| Water | PAA | S15-012 | cell culture grade |
| PBS | PAA | H15-002 | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 0.45 μm Sterile filter | Sartorius | 16555 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 75 cm2 Tissue culture flask | BD Falcon | 353136 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ7.5 | |
| Stereomicroscope + Camera | Leica | MZ16F; DFC320 | |
| Microscope + Camera | Zeiss; Canon | Primo Vert; PowerShot A650 IS | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Water bath | Julabo | SW20; 37 °C |
References
- Nedergaard, M., Ransom, B., Goldman, S. A. New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain. Trends Neurosci. 26, 523-530 (2003).
- Belanger, M., Allaman, I., Magistretti, P. J. Brain energy metabolism: focus on astrocyte-neuron metabolic cooperation. Cell Metab. 14, 724-738 (2011).
- Allen, N. J., Barres, B. A. Neuroscience: Glia – more than just brain glue. Nature. 457, 675-677 (2009).
- Ballas, N., Lioy, D. T., Grunseich, C., Mandel, G. Non-cell autonomous influence of MeCP2-deficient glia on neuronal dendritic morphology. Nat. Neurosci. 12, 311-317 (2009).
- Jacobs, S., Nathwani, M., Doering, L. C. Fragile X astrocytes induce developmental delays in dendrite maturation and synaptic protein expression. BMC Neurosci. 11, 132 (2010).
- Kaneko, N., et al. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
- Min, R., Nevian, T. Astrocyte signaling controls spike timing-dependent depression at neocortical synapses. Nat. Neurosci. , (2012).
- Eroglu, C., Barres, B. A. Regulation of synaptic connectivity by glia. Nature. 468, 223-231 (2010).
- Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. Action-potential modulation during axonal conduction. Science. 331, 599-601 (2011).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via VEGF signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 .
- Alvarez, J. I., et al. The Hedgehog pathway promotes blood-brain barrier integrity and CNS immune quiescence. Science. 334, 1727-1731 (2011).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).
- Tao-Cheng, J. H., Nagy, Z., Brightman, M. W. Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia. J. Neurosci. 7, 3293-3299 (1987).
- Gordon, G. R., Choi, H. B., Rungta, R. L., Ellis-Davies, G. C., MacVicar, B. A. Brain metabolism dictates the polarity of astrocyte control over arterioles. Nature. 456, 745-749 (2008).
- Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nat. Rev. Neurosci. 5, 146-156 (2004).
- Schachtrup, C., Moan, N. L. e., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10, 1764-1771 (2011).
- Schachtrup, C., et al. Fibrinogen triggers astrocyte scar formation by promoting the availability of active TGF-beta after vascular damage. J. Neurosci. 30, 5843-5854 (2010).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. J. Neurosci. 22, 183-192 (2002).
- Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neurosciences. 113, 221-233 (2002).
- Dabir, D. V., et al. Impaired glutamate transport in a mouse model of tau pathology in astrocytes. J. Neuroscience. 26, 644-654 (2006).
- Wisniewski, H. M., Wegiel, J. Spatial relationships between astrocytes and classical plaque components. Neurobiol. Aging. 12, 593-600 (1991).
- Shin, J. Y., et al. Expression of mutant huntingtin in glial cells contributes to neuronal excitotoxicity. J. Cell Biol. 171, 1001-1012 (2005).
- Wakabayashi, K., Hayashi, S., Yoshimoto, M., Kudo, H., Takahashi, H. NACP/alpha-synuclein-positive filamentous inclusions in astrocytes and oligodendrocytes of Parkinson’s disease brains. Acta Neuropathol. 99, 14-20 (2000).
- Lioy, D. T., et al. A role for glia in the progression of Rett’s syndrome. Nature. 475, 497-500 (2011).
- Quinlan, R. A., Brenner, M., Goldman, J. E., Messing, A. GFAP and its role in Alexander disease. Exp. Cell Res. 313, 2077-2087 (2007).
- Beck, K., Schachtrup, C. Vascular damage in the central nervous system: a multifaceted role for vascular-derived TGF-beta. Cell Tissue Res. 347, 187-201 (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Siao, C. J., Tsirka, S. E. Tissue plasminogen activator mediates microglial activation via its finger domain through annexin II. J. Neurosci. 22, 3352-3358 (2002).
- Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28, 264-278 (2008).
- Anthony, T. E., Heintz, N. The folate metabolic enzyme ALDH1L1 is restricted to the midline of the early CNS, suggesting a role in human neural tube defects. J. Comp. Neurol. 500, 368-383 (2007).
- Skoff, R. P., Knapp, P. E. Division of astroblasts and oligodendroblasts in postnatal rodent brain: evidence for separate astrocyte and oligodendrocyte lineages. Glia. 4, 165-174 (1991).
- Molofsky, A. V., et al. Astrocytes and disease: a neurodevelopmental perspective. Genes Dev. 26, 891-907 (2012).
- Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr. Opin. Neurobiol. 20, 588-594 (2010).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71, 799-811 (2011).
- Jungblut, M., et al. Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1. Glia. 60, 894-907 (2012).
