在体内双光子成像的经验依赖的分子在大脑皮质神经元的变化
1Unit on Neural Circuits and Adaptive Behaviors, Genes Cognition and Psychosis Program,National Institute of Mental Health, 2Department of Neuroscience,Brown University – National Institutes of Health Graduate Partnership Program, 3Section on Synaptic Pharmacology, Laboratory for Integrative Neuroscience,National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, 4Champalimaud Neuroscience Programme,Champalimaud Center for the Unknown
Summary
经验依赖的分子在神经元的变化是大脑的能力相适应，行为问题的关键。一个<em在体内</em>双光子成像方法的描述，在这里，可以追踪个人皮层神经元的分子变化，通过基因编码的记者。
Abstract
大脑的能力来改变响应经验健康的大脑功能是必不可少的，并且在这个过程中的异常导致的脑功能障碍的各种1,2。为了更好地理解大脑回路的反应机制，动物的经验，需要能够监控的经验依赖的分子在一个给定的神经元的变化，在相当长的一段时间内，在活的动物。虽然经验和相关联的神经活动被称为触发1,2在神经元中的基因表达的变化，大多数的方法来检测这样的变化不允许重复观察多天相同的神经元的或不具有足够的分辨率来观察单个神经元的3 ，4。在这里，我们描述了在体内双光子显微镜相结合的方法，经验依赖的基因表达的改变在个别大脑皮质神经元的基因编码的荧光记者跟踪当然，每天的日常经验。
一个行之有效的经验依赖的基因活动调节细胞骨架相关蛋白（ARC）5,6。转录的弧是迅速和高度诱导的神经元的活动加剧3，其蛋白产物调控谷氨酸受体的内吞作用和长时程突触可塑性7。电弧中的表达已被广泛使用作为分子标记映射涉及在特定的行为3的神经回路。在这些研究中，电弧的表达在固定的脑组织切片的原位杂交或免疫组化检测。虽然这些方法发现的表达定位于弧后行为的经验，如何弧的表达模式可能会改变的细胞反复多次发作或独特的经历，天兴奋性神经元的一个子集。
ntent“ 在体内双光子显微镜提供了一个强大的方法来考察经验依赖的细胞变化的活脑8,9。为了使双光子显微镜检查弧在现场神经元中的表达，我们以前产生了连锁反应鼠标线中，在其中的GFP记者弧的内源性启动子10的控制下被放置。此协议描述了外科手术准备和跟踪的经验依赖性电弧GFP表达模式在神经元中的活的动物的合奏的成像程序，在该方法中，慢性头颅窗弧-GFP小鼠的皮质区植入这些动物，然后反复后几天的过程中所需的行为范式的双光子显微镜拍摄，这种方法一般适用于动物携带其他的荧光记者的经验依赖的分子变化4。Protocol
下面描述的实验过程的心理健康动物管理和使用委员会由国家批准，并按照国家研究院实验动物护理和使用健康指南 。 1。手术前准备在炎热的珠灭菌器无菌手术前清洗所有的工具，清洁手术部位用70％的乙醇，放下干净的罩布。戴无菌手套。与新鲜制备的1.2％阿佛丁解决方案，由于在0.02毫升/克，腹腔注射麻醉动物。或者，麻醉用异氟醚气体通过一个鼻锥体，…
Representative Results
该协议描述了一个方法来跟踪个人皮层神经元在活的动物的经验依赖的分子变化。一种慢性颅窗口第一次创建了一个带有荧光的记者在小鼠基因表达的兴趣皮层区域。双光子显微镜然后可以加上各种行为范式来观察行为诱导的分子变化，个别神经元和跟踪多天（ 图1）在相同的一组神经元中的这种变化。 弧-GFP小鼠，可以可靠地成像依赖于经验在Arc基因的表达…
Discussion
这里描述的体内成像方法，使弧基因表达的变化在相同的一组神经元在活的动物多天的反复检查。这是一个高效，灵活的方法来获取信息在单个神经元的神经可塑性相关的分子动力学响应不同的行为体验。标准组织化学方法，如原位杂交和免疫组织化学可以实现单细胞的第3号决议，但缺乏能够跟踪多天在同一个神经元的基因表达的变化。通过适当记者15生物发光，磁…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者想感谢L. Belluscio对手术的摄影器材，D.权进行拍摄的援助，K.，用于视频编辑的援助，和K.麦克劳德所有的背景音乐。 KW承认院内研究项目的镍氢电池事业部和基因，认知和精神病计划的慷慨支持。这项工作是支持的镍氢电池院内研究计划（VC，YY，SMKW），和NIAAA部院内临床和生物研究发展计划（VC，RMC，DML）。
Materials
| Name of the Equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| FV1000 multi-photon laser scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | Imaging |
| Dissection microscope | Omano | 555V107 | Surgery |
| Stereotaxis surgery stage for mice | Harvard Apparatus | 726335 | Surgery |
| 20X or 25X water immersion objective | Olympus | XLPL25XWMP | Imaging |
| Microscope stage with head-fixation frame | Custom made | N/A | Imaging |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Surgery |
| Dental drill burr | Fine Science Tools | 19007-05 | Surgery |
| CCD camera | QImaging | QICAM 12-bit | Imaging |
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Citer Cet Article
Cao, V. Y., Ye, Y., Mastwal, S. S., Lovinger, D. M., Costa, R. M., Wang, K. H. In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (71), e50148, doi:10.3791/50148 (2013).