في الجسم الحي ثنائي الفوتون التصوير من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية
Summary
تجربة تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية ضرورية لقدرة الدماغ على التكيف استجابة للتحديات السلوكية. على<em> في الجسم الحي</emيوصف> ثنائي الفوتون التصوير هنا طريقة التي تسمح للتتبع مثل هذه التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية الفردية من خلال ترميز للصحفيين وراثيا.
Abstract
قدرة الدماغ على تغيير استجابة لتجربة أمر ضروري لوظيفة الدماغ صحية، وتشوهات في هذه العملية تسهم في مجموعة متنوعة من 1،2 اضطرابات الدماغ. لفهم أفضل للآليات التي دوائر المخ تستجيب لتجربة الحيوان يتطلب القدرة على رصد التغيرات الجزيئية التي تعتمد على الخبرة في مجموعة معينة من الخلايا العصبية، على مدى فترة طويلة من الزمن، في الحيوانات الحية. بينما هو معروف الخبرة والنشاط العصبي لتحريك التغييرات المرتبطة التعبير الجيني في الخلايا العصبية 1،2، أكثر من الأساليب للكشف عن مثل هذه التغييرات لا تسمح المراقبة المتكررة من الخلايا العصبية نفسها خلال الأيام متعددة أو لم يكن لديك ما يكفي من القرار لمراقبة الخلايا العصبية الفردية 3 ، 4. هنا، نحن تصف طريقة يجمع بين الجسم الحي في اثنين من الفوتون المجهري مع مراسل الفلورسنت المشفرة وراثيا لتتبع التغيرات التي تعتمد على تجربة التعبير الجيني في الخلايا العصبية القشرية الفردية على بالطبع من يوم إلى يوم التجربة.
واحد من الجينات التي تعتمد على تجربة راسخة هي نشاط التنظيم البروتين يرتبط بها من هيكل الخلية (قوس) 5،6. نسخ من قوس هو بسرعة والتي يسببها النشاط المكثف للغاية من قبل الخلايا العصبية 3، والبروتين الناتج ينظم الإلتقام مستقبلات الغلوتامات من وطويلة الأجل اللدونة متشابك 7. وقد تم التعبير عن قوس تستخدم على نطاق واسع كعلامة الجزيئية لرسم خريطة الدوائر العصبية المشاركة في سلوكيات معينة 3. في معظم تلك الدراسات، تم الكشف عن قوس التعبير في الموقع التهجين أو المناعية في المخ أقسام ثابتة. على الرغم من كشف هذه الأساليب التي تم ترجمة تعبير عن قوس إلى مجموعة فرعية من الخلايا العصبية مثير بعد تجربة السلوكية، وكيف تم التحقيق في أنماط لا الخلوية التعبير القوس قد تتغير مع نوبات متعددة من التجارب المتكررة أو مميزة خلال الأيام.
ntent "> في الجسم الحي ثنائي الفوتون المجهري يوفر وسيلة قوية لدراسة تجربة تعتمد على التغيرات الخلوية في الدماغ المعيشة 8،9. لتمكين الفحص التعبير قوس في الخلايا العصبية الحية من قبل اثنين من الفوتون المجهري، ونحن ولدت في السابق للخبط في خط الماوس التي يتم وضعها مراسل GFP تحت سيطرة المروج قوس الذاتية 10. هذا البروتوكول يصف الاستعدادات والإجراءات الجراحية التصوير لتتبع التجربة التي تعتمد على أنماط التعبير GFP في قوس الفرق العصبية في الحيوانات الحية. في هذه الطريقة ، تم زرع Windows أولا الجمجمة المزمنة في قوس GFP الفئران فوق المناطق القشرية في المصالح. تم تصويرها ثم تلك الحيوانات مرارا وتكرارا من قبل اثنين من الفوتون المجهري بعد نماذج السلوك المطلوب على مدى عدة أيام، وهذا الأسلوب قد تكون قابلة للتطبيق عموما للحيوانات تحمل للصحفيين الفلورسنت الأخرى من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية 4.Protocol
Representative Results
Discussion
وطريقة التصوير في الجسم الحي وصفها هنا يمكن فحص المتكرر للقوس التغييرات التعبير الجيني في الخلايا العصبية مجموعات نفس خلال الأيام متعددة في الحيوانات الحية. انها وسيلة فعالة ومرنة للحصول على معلومات حول الديناميات اللدونة العصبية الجزيئية ذات الصلة في الخلاي?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أود أن أشكر L. لمعدات التصوير Belluscio الجراحة، D. كوون المساعدة للتصوير، K. ليو لتحرير الفيديو المساعدة، وماكلويد K. لجميع موسيقى خلفية. KW يعترف بدعم سخي من شعبة NIMH من برامج بحثية ضمن الجدران والجينات، والإدراك وبرنامج الذهان. وأيد هذا العمل من قبل برنامج بحوث NIMH ضمن الجدران (VC، YY، SMKW) وشعبة NIAAA من ضمن الجدران برنامج البحوث السريرية والبيولوجية (VC، RMC، DML).
Materials
| Name of the Equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| FV1000 multi-photon laser scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | Imaging |
| Dissection microscope | Omano | 555V107 | Surgery |
| Stereotaxis surgery stage for mice | Harvard Apparatus | 726335 | Surgery |
| 20X or 25X water immersion objective | Olympus | XLPL25XWMP | Imaging |
| Microscope stage with head-fixation frame | Custom made | N/A | Imaging |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Surgery |
| Dental drill burr | Fine Science Tools | 19007-05 | Surgery |
| CCD camera | QImaging | QICAM 12-bit | Imaging |
References
- Leslie, J. H., Nedivi, E. Activity-regulated genes as mediators of neural circuit plasticity. Progress in neurobiology. 94 (3), 223-237 (2011).
- Flavell, S. W., Greenberg, M. E. Signaling mechanisms linking neuronal activity to gene expression and plasticity of the nervous system. Annual review of neuroscience. 31, 563-590 (2008).
- Guzowski, J. F., et al. Mapping behaviorally relevant neural circuits with immediate-early gene expression. Current opinion in neurobiology. 15 (5), 599-606 (2005).
- Barth, A. L. Visualizing circuits and systems using transgenic reporters of neural activity. Curr. Opin. Neurobiol. 17 (5), 567-5671 (2007).
- Lyford, G. L., et al. a growth factor and activity-regulated gene, encodes a novel cytoskeleton-associated protein that is enriched in neuronal dendrites. Neuron. 14 (2), 433-445 (1995).
- Link, W., et al. Somatodendritic expression of an immediate early gene is regulated by synaptic activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5734-5738 (1995).
- Shepherd, J. D., Bear, M. F. New views of Arc, a master regulator of synaptic plasticity. Nature neuroscience. 14 (3), 279-284 (2011).
- Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in Neurosciences. 34 (4), 177-187 (2011).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Wang, K. H., et al. In vivo two-photon imaging reveals a role of arc in enhancing orientation specificity in visual cortex. Cell. 126 (2), 389-402 (2006).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J. Vis. Exp. (12), e680 (2008).
- Dombeck, D. A., et al. Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake. Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Zipfel, W. R. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. PNAS. 100 (12), 7075-7080 (2003).
- Eichhoff, G. In vivo calcium imaging of the aging and diseased brain. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 99-106 (2008).
- Klohs, J., Rudin, M. Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist: a review journal bringing neurobiology. neurology and psychiatry. 17 (5), 539-559 (2011).
- Chen, L. M., et al. A chamber and artificial dura method for long-term optical imaging in the monkey. Journal of neuroscience. 113 (1), 41-419 (2002).
- Kleinfeld, D., et al. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
- Barretto, R. P., et al. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).
- Stosiek, C., et al. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
