In Vivo Imagerie biphotonique d'expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les neurones corticaux
Summary
Expérience dépendant des changements moléculaires dans les neurones sont essentiels pour la capacité du cerveau à s'adapter en réponse à des problèmes de comportement. Un<em> In vivo</emMéthode d'imagerie> à deux photons est décrit ici, qui permet le suivi de ces changements moléculaires dans les différents neurones corticaux par les journalistes génétiquement codés.
Abstract
La capacité du cerveau de changer en réponse à l'expérience est essentielle pour le fonctionnement sain du cerveau et des anomalies dans ce processus contribue à une variété de troubles neurologiques 1,2. Pour mieux comprendre les mécanismes par lesquels les circuits du cerveau réagissent à l'expérience d'un animal nécessite la capacité de surveiller les changements vécus par dépendantes moléculaires dans un ensemble donné de neurones, sur une période de temps prolongée, chez l'animal vivant. Bien que l'expérience et l'activité neuronale associée est connu pour déclencher des changements d'expression des gènes dans les neurones 1,2, la plupart des méthodes pour détecter ces changements ne permettent pas l'observation répétée des mêmes neurones sur plusieurs jours ou qui n'ont pas une résolution suffisante pour observer les neurones individuels 3 , 4. Nous décrivons ici une méthode qui combine in vivo microscopie à deux photons avec un journaliste codées génétiquement fluorescent pour suivre l'expérience dépendant de changements d'expression génétique dans les différents neurones corticaux au cours de la cours de la journée-à-jour l'expérience.
L'une des expériences bien établies qui dépendent gènes est régulée l'activité protéine du cytosquelette associée (Arc) 5,6. La transcription d'Arc est rapidement et fortement induite par l'intensification de l'activité neuronale 3, et son produit protéique régule l'endocytose des récepteurs au glutamate et à long terme de plasticité synaptique 7. L'expression d'Arc a été largement utilisé comme un marqueur moléculaire pour cartographier les circuits neuronaux impliqués dans les comportements spécifiques 3. Dans la plupart de ces études, l'expression Arc a été détecté par hybridation de situ ou immunohistochimie dans des coupes de cerveau fixes. Bien que ces méthodes ont révélé que l'expression d'Arc a été localisé à un sous-ensemble de neurones excitateurs après l'expérience du comportement, la façon dont les modèles cellulaires d'expression Arc pourrait changer avec de multiples épisodes d'expériences répétées sur plusieurs jours ou distinctif n'a pas été étudiée.
ntent "> In vivo microscopie à deux photons offre un moyen puissant d'examiner l'expérience qui dépendent des changements cellulaires dans le cerveau 8,9 vivre. Afin de permettre l'examen de l'expression Arc de neurones vivants par microscopie à deux photons, nous avons déjà généré un knock- en ligne de la souris dans lequel un rapporteur GFP est placé sous le contrôle du promoteur endogène d'arc 10. Ce protocole décrit la préparation et procédures chirurgicales pour le suivi de l'expérience d'imagerie dépendant de profils d'expression Arc-GFP dans des ensembles de neurones chez l'animal vivant. Dans ce procédé , chroniques fenêtres crâniennes ont d'abord été implanté à Arc-GFP souris sur les régions corticales d'intérêt. Ces animaux ont ensuite été reprises imagée par microscopie à deux photons après souhaités paradigmes comportementaux au cours de plusieurs jours. Cette méthode peut être applicable aux animaux porteurs d'autres reporters fluorescents d'expérience dépendant de changements moléculaires 4.Protocol
Representative Results
Discussion
L'imagerie de vivo méthode décrite ici permet l'examen répété des changements d'expression des gènes dans l'arc les mêmes ensembles de neurones sur plusieurs jours chez l'animal vivant. Il s'agit d'une méthode efficace et polyvalent pour obtenir des informations sur la plasticité neuronales liées à la dynamique moléculaire dans les neurones individuels en réponse à diverses expériences comportementales. Standard des méthodes histochimiques comme l'hyb…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier L. Belluscio de matériel de tournage chirurgie, D. Kwon pour le tournage d'assistance, K. Liu pour le montage vidéo assistance, et K. MacLeod pour toute la musique de fond. KW reconnaît le soutien généreux de la Division des programmes de recherche NIMH intra-muros et les gènes, Cognition et Psychosis Program. Ce travail a été soutenu par le Programme de recherche intra-muros NIMH (VC, YY, SMKW) et la Division NIAAA du programme de recherche intra-muros clinique et biologique (VC, RMC, DML).
Materials
| Name of the Equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| FV1000 multi-photon laser scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | Imaging |
| Dissection microscope | Omano | 555V107 | Surgery |
| Stereotaxis surgery stage for mice | Harvard Apparatus | 726335 | Surgery |
| 20X or 25X water immersion objective | Olympus | XLPL25XWMP | Imaging |
| Microscope stage with head-fixation frame | Custom made | N/A | Imaging |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Surgery |
| Dental drill burr | Fine Science Tools | 19007-05 | Surgery |
| CCD camera | QImaging | QICAM 12-bit | Imaging |
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