Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler
Summary
Nöronlarda deneyim-bağımlı moleküler değişiklikler davranışsal sorunlara yanıt olarak adapte beyin yeteneği için gereklidir. An<em> In vivo</em> Iki foton görüntüleme yöntemi genetik olarak kodlanmış gazetecilere yoluyla bireysel kortikal nöronların bu tür moleküler değişiklikleri izleme sağlayan burada tanımlanmıştır.
Abstract
Deneyimi yanıt olarak değiştirmek için beyin yeteneği sağlıklı beyin fonksiyonu için önemlidir ve bu süreçte anormallikler beyin bozuklukları 1,2 çeşitli katkıda. Iyi beyin devrelerinin bir hayvanın deneyimi tepki hangi mekanizmalar anlamak için canlı hayvan, zaman uzun bir süre boyunca, nöronların belirli bir set deneyimi bağımlı moleküler değişiklikleri izlemek için yeteneği gerektirir. Deneyim ve ilişkili nöral aktivitenin nöronlar 1,2 gen ekspresyon değişiklikleri tetiklemek için bilinen iken, yöntemlerin çoğu bu değişiklikleri algılamak için birden fazla gün içinde aynı nöronların tekrar gözlem izin vermez ya da bireysel nöronlar 3 gözlemlemek için yeterli çözünürlüğe sahip değilsiniz , 4. Burada, üzerinde bireysel kortikal nöronların deneyim-bağımlı gen ekspresyon değişiklikleri izlemek için genetik olarak kodlanmış floresan muhabiri olan iki foton mikroskopi vivo birleştiren bir yöntem tarif gün-gün deneyim tabii.
Köklü deneyimi bağımlı genlerden biri Aktivite regüle sitoskeletal ilişkili protein (Arc) 5,6 olduğunu. Arc transkripsiyon hızla ve son derece yoğunlaştırılmış nöronal aktivitenin 3 ile tetiklenen, ve onun protein ürünü glutamat reseptörleri ve uzun vadeli sinaptik plastisite 7 endositoz düzenler. Arc ifadesi yaygın 3 özel davranış katılan nöral devrelerin eşlemek için bir moleküler belirteç olarak kullanılmıştır. Bu çalışmaların çoğunda, Arc ifadesi sabit beyin bölümlerinde situ hibridizasyon veya immünohistokimya saptandı. Bu yöntemleri Arc ifade Arc ifade hücresel desenleri gün boyunca tekrarlanan ya da farklı deneyimler çoklu atakları ile değişebilir incelenmiştir değildi nasıl davranışsal deneyim, sonra eksitatör nöronların bir alt kümesi lokalize olduğunu göstermiştir rağmen.
ntent "> in vivo iki foton mikroskopi canlı beyin 8,9 deneyim bağımlı hücresel değişiklikleri incelemek için güçlü bir yol sunar. iki foton mikroskopi ile canlı nöronlar Arc ifade muayene etkinleştirmek için, önceden oluşturulan bir knock- fare doğrultusunda bir GFP muhabiri endojen Arc organizatörü 10 kontrolü altında yerleştirilir. hangi Bu protokol cerrahi hazırlıkları ve canlı hayvan nöronal toplulukları deneyim-bağımlı Arc-GFP ifade desenleri izlemek için görüntüleme yöntemleri anlatılmaktadır. Bu yöntemde , kronik kranial pencereler ilk ilgi kortikal bölgeler üzerinde Arc-GFP fareler implante edildi. Bu hayvanlar daha sonra art arda birkaç gün boyunca istenilen davranış paradigmaları sonra iki foton mikroskopi ile görüntülenmiştir. Bu yöntem taşıyan hayvanların genel olarak uygulanabilir olabilir diğer floresan gazetecilere deneyim-bağımlı moleküler değişikliklere 4.Protocol
Representative Results
Discussion
In vivo görüntüleme yöntemi burada açıklanan canlı hayvan birden fazla gün içinde nöronların aynı setleri Arc gen ekspresyon değişiklikleri tekrar muayene sağlar. Çeşitli davranışsal deneyimler yanıt bireysel nöronların nöral plastisite ile ilgili moleküler dinamiği hakkında bilgi edinmek için etkin ve çok yönlü bir yöntemdir. Böyle situ hibridizasyon ve immün olarak Standart histokimyasal yöntemler çözünürlüğü 3 tek hücreli ul…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar yardımı filme yönelik cerrahi filme ekipmanları, D. Kwon L. Belluscio teşekkür etmek istiyorum, video için K. Liu tüm arka plan müziği için yardım düzenleme ve K. MacLeod. KW İntramural Araştırma Programları NIMH Bölümü ve Genler, Biliş ve Psikoz Programı cömert desteğini onaylar. Bu çalışma NIMH İntramural Araştırma Programı (VC, YY, SMKW) ve intramural Klinik ve Biyolojik Araştırma Programı NIAAA Bölümü (VC, RMC, DML) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the Equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| FV1000 multi-photon laser scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | Imaging |
| Dissection microscope | Omano | 555V107 | Surgery |
| Stereotaxis surgery stage for mice | Harvard Apparatus | 726335 | Surgery |
| 20X or 25X water immersion objective | Olympus | XLPL25XWMP | Imaging |
| Microscope stage with head-fixation frame | Custom made | N/A | Imaging |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Surgery |
| Dental drill burr | Fine Science Tools | 19007-05 | Surgery |
| CCD camera | QImaging | QICAM 12-bit | Imaging |
References
- Leslie, J. H., Nedivi, E. Activity-regulated genes as mediators of neural circuit plasticity. Progress in neurobiology. 94 (3), 223-237 (2011).
- Flavell, S. W., Greenberg, M. E. Signaling mechanisms linking neuronal activity to gene expression and plasticity of the nervous system. Annual review of neuroscience. 31, 563-590 (2008).
- Guzowski, J. F., et al. Mapping behaviorally relevant neural circuits with immediate-early gene expression. Current opinion in neurobiology. 15 (5), 599-606 (2005).
- Barth, A. L. Visualizing circuits and systems using transgenic reporters of neural activity. Curr. Opin. Neurobiol. 17 (5), 567-5671 (2007).
- Lyford, G. L., et al. a growth factor and activity-regulated gene, encodes a novel cytoskeleton-associated protein that is enriched in neuronal dendrites. Neuron. 14 (2), 433-445 (1995).
- Link, W., et al. Somatodendritic expression of an immediate early gene is regulated by synaptic activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5734-5738 (1995).
- Shepherd, J. D., Bear, M. F. New views of Arc, a master regulator of synaptic plasticity. Nature neuroscience. 14 (3), 279-284 (2011).
- Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in Neurosciences. 34 (4), 177-187 (2011).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Wang, K. H., et al. In vivo two-photon imaging reveals a role of arc in enhancing orientation specificity in visual cortex. Cell. 126 (2), 389-402 (2006).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J. Vis. Exp. (12), e680 (2008).
- Dombeck, D. A., et al. Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake. Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Zipfel, W. R. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. PNAS. 100 (12), 7075-7080 (2003).
- Eichhoff, G. In vivo calcium imaging of the aging and diseased brain. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 99-106 (2008).
- Klohs, J., Rudin, M. Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist: a review journal bringing neurobiology. neurology and psychiatry. 17 (5), 539-559 (2011).
- Chen, L. M., et al. A chamber and artificial dura method for long-term optical imaging in the monkey. Journal of neuroscience. 113 (1), 41-419 (2002).
- Kleinfeld, D., et al. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
- Barretto, R. P., et al. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).
- Stosiek, C., et al. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
