العزلة وثقافة الأطفال حديثي الولادة ماوس العضلية

Summary

الأولية الثقافات الماوس cardiomyocyte هي واحدة من الأدوات المحورية للتحقيق في منظمة myofibrillar وظيفة. يصف بروتوكول التالية العزلة وثقافة العضلية الأولية من قلوب الماوس حديثي الولادة. ويمكن استخدام الثقافات cardiomyocyte الناتجة لاحقا لمجموعة متنوعة من النشاط الحيوي، فحوصات البيوكيميائية وخلايا البيولوجية.

Abstract

لطالما استخدمت العضلية الولدان مثقف لدراسة myofibrillogenesis وظائف myofibrillar. العضلية مثقف تسمح للتحقيق سهلة والتلاعب من المسارات البيوكيميائية، وتأثيرها على خصائص النشاط الحيوي للضرب عفويا العضلية.

يصف بروتوكول 2 يوما بعد العزلة وثقافة العضلية الماوس حديثي الولادة. وتبين لنا كيفية تشريح بسهولة قلوب من حديثي الولادة، فصل الأنسجة العضلية القلبية وإثراء من القلب خلية السكان. نناقش استخدام انزيم يمزج مختلفة لخلية التفكك، وآثارها على الخلية قدرتها على البقاء. والعضلية معزولة يمكن استخدامها في وقت لاحق لمجموعة متنوعة من المورفولوجية، الكهربية، والكيمياء الحيوية، المقايسات خلية بيولوجية أو النشاط الحيوي. نحن الأمثل لبروتوكول لمتانة والتكاثر، باستخدام الحلول الوحيدة المتاحة تجاريا والتي تختلط انزيم SHآه القليل الكثير إلى الكثير تقلب. نحن أيضا معالجة المشاكل المشتركة المرتبطة العزلة وثقافة العضلية، وتوفر مجموعة متنوعة من الخيارات لتحقيق أقصى استفادة ممكنة من العزلة والثقافة الشروط.

Introduction

أقرب تقارير عن التفكك ناجحة وثقافة خلايا القلب القوارض يعود تاريخها الى عام ^1،2 في عام 1960. حتى ذلك الحين، لاحظت Harary وفارلي أن العضلية مثقف "قد توفر نظاما فريدا لدراسة متطلبات انقباض الدوري [ويجوز] توفير وسيلة لتحديد مساهمة مختلف المسارات الأيضية لل[الضرب] العملية". على الرغم من Harary وفارلي العضلية معزولة ومثقف من صغار الفئران، والبروتوكول الأصلي قد تم تكييفها وتعديلها من قبل العديد من العلماء على مر السنين، لم يتغير كثيرا من العزلة وزراعة الإجراء العام. ومع ذلك، والانزيمات أفضل ³ حلول موحدة ^4،5، وإضافة قناة عكسها والميوسين أتباز المانع BDM لحماية الخلايا أثناء إجراء العزل ^6-9 قد تحسنت بشكل ملحوظ الخلوي العائد والجدوى.

الكبار مقابل cardiomyo حديثي الولادةcytes

العضلية معزولة ومثقف من الفئران او الجرذان حديثي الولادة لديها العديد من المزايا ثقافات العضلية الكبار. قبل كل شيء، وإجراء العزل لحديثي الولادة الماوس أو الفئران القلوب هو أسهل وأقل تكلفة، إذا ما قورنت إلى عزل العضلية من الماوس الكبار أو الفئران ^10. حديثي الولادة العضلية هي أقل حساسية بكثير لإعادة إلى المتوسطة التي تحتوي على الكالسيوم بعد التفكك، وزيادة كبيرة الخلوي العائد. ميزة كبيرة أخرى هي أن العضلية الماوس حديثي الولادة الخضوع لفقد التمايز أسرع – دورة عودة التمايز الذي ينتج عادة في ضرب الخلايا عفويا 20 ساعة بعد الطلاء، في حين تتطلب العضلية الكبار عادة للحث على سرعة الانكماش. العضلية حديثي الولادة هي أيضا أكثر بسهولة transfectable مع أساليب الليبوسومال ترنسفكأيشن، في حين العضلية الكبار تتطلب النواقل الفيروسية للتسليم ناجحة من الحمض النووي المعدل وراثيا. وعلى النقيض من cardiomyocyte حديثي الولادةق، ثقافة العضلية القوارض الكبار ^11-13 يسمح للتحقيقات من تدهور myofibrillar وإعادة في نهاية المطاف من جهاز مقلص. هذه التغييرات شكلية متميزة في العضلية الكبار تحدث على مدى فترات من 1-2 أسابيع. ويرافق عودة التمايز من خلال دورة reexpression من البرنامج الجيني الجنين، وبالتالي محاكاة التغيرات المرضية التي لوحظت في الإنسان بعضلة القلب ¹⁴ – وفقد التمايز. ميزة أخرى من الفئران العضلية الكبار على ثقافة العضلية حديثي الولادة هو القدرة على ثقافة هذه الخلايا لفترات طويلة من الزمن.

الفئران مقابل العضلية الماوس

العزلة وثقافة العضلية الفئران حديثي الولادة لديها بعض الفوائد من خلال تلك الماوس العضلية حديثي الولادة، بما في ذلك عائدات أعلى من خلايا قابلة للحياة وزيادة معدلات ترنسفكأيشن. ومع ذلك، فإن استخدام واسعة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا لعلاج أمراض القلب (على سبيل المثال <م /> وليم العضلات بروتين بالضربة القاضية الماوس كنموذج للتمدد عضلة القلب ¹⁵⁾ قد أدى إلى التكيف من إجراء العزل لالعضلية المستمدة من الفئران حديثي الولادة. على الرغم من أن البروتوكولات المستخدمة لعزل الجرذان والفئران حديثي الولادة العضلية هي متطابقة تقريبا، يجب توخي الحذر أكبر في اختيار مزيج انزيم المناسبة لهذا الأخير. في الواقع، العضلية الماوس حديثي الولادة عادة ما تكون أكثر عرضة للoverdigestion، مما أدى إلى انخفاض العائد الخلية وقدرتها على البقاء. علاوة على ذلك، ينبغي تعديل كثافة الطلاء، لأن العضلية المستمدة من الفئران حديثي الولادة هي أصغر نوعا ما مقارنة مع الخلايا المشتقة من قلوب الفئران حديثي الولادة.

مع العديد من الاستخدامات للتحقيق في، الكهربية، والكيمياء الحيوية، المعلمات الخلية البيولوجية والمورفولوجية النشاط الحيوي وكذلك لعملية myofibrillogenesis، أصبحت العضلية الولدان مثقف واحد من أكثر الأنظمة تنوعا لدراسةوظائف الخلية القلبية في المختبر. الخطوة الأولى لمقايسة ناجحة ومع ذلك، يعتمد على منهجية سهلة وموثوقة لعزل العضلية الماوس حديثي الولادة. بروتوكول لدينا توجه منهجيته من مصادر عديدة، وكان الأمثل لاستنساخ ومتانة. نناقش العوامل التي تؤثر cardiomyocyte الغلة وقدرتها على البقاء، وتوفير مجموعة متنوعة من الخيارات لتحقيق أقصى استفادة ممكنة من العزلة والثقافة الشروط.

Protocol

يصف الإجراء التالي ل16،17 بروتوكول لمدة يومين للعزلة وثقافة العضلية الماوس حديثي الولادة. كل الحلول هي معقمة أو معقمة تصفيتها. يتم تعقيم جميع الأدوات التي كتبها تعقيم السطح مع 75٪ من الإيثانول. باستثناء لاستخراج الأنسجة الأولية، يتم تنفيذ جميع الخطوات في العقيمة…

Representative Results

باستخدام هذا البروتوكول، ونحن عزل قلوب من 8 يوم واحد الفئران حديثي الولادة القديمة (أرقام 1A، 1B، خلفية فيلم S1). بعد الغسيل وتنميق قلوب مع مقص (أرقام 1C-1F)، ومهضوم شظايا الأنسجة في عزلة المتوسطة أكثر من ليلة في 4 درجات مئوية مع الإثارة لطيف. بعد هضم مسبق <st…

Discussion

أصبح استخدام نماذج حيوانية لدراسة أمراض القلب القياسية في مجال البحوث القلب والأوعية الدموية. توصيف البيوكيميائية أقرب من هذه النماذج (أي دراسة الاستجابات المباشرة للخلايا القلب للمؤثرات الكيميائية الحيوية أو النشاط الحيوي) وعادة ما يتطلب عزل أنسجة القلب أو ا…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8	Sigma	B-0753	prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.
Collagenase/Dispase	Roche	10269638001	can be substituted with collagenase type II from Worthington
Collagenase type II3	Worthington	CLS-2	substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA	e.g. cellgro	25-053-CI
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS	e.g. cellgro	30-002-Cl
1x PBS (without Ca2+, Mg2+)	e,g, cellgro	21-040-CV
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4	e.g. cellgro	21-022-CV
DMEM high glucose	e.g. cellgro	10-013-CV
M-199	e.g. cellgro	10-060-CV
fetal bovine serum	e.g. cellgro	35-011-CV	cell-culture grade
horse serum	e.g. cellgro	35-030-CV	cell-culture grade
Leibovitz L-155	e.g. cellgro	10-045-CV
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)	Sigma	C-6645	proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C
phenylephrine	Sigma	P-6126	chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
isoproterenol hydrochloride	Sigma	I-6501	chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
0.1% collagen solution	Sigma	C-8919	extracellular matrix for coating
3 mg/ml collagen type 1 solution	Advanced BioMatrix	5005-B	alternative to Sigma collagen solution
cell strainer	e.g. Fisherbrand	22363548	appropriate filter size:40 μm-100 μm
syringe filter 0.2 μm	e.g. Fisherbrand	09-719C	for sterile filtration of digestion medium
straight scissors	e.g. Fine Sciences Tools	91460-11
curved scissors	e.g. Fine Science Tools	91461-11
Dumont No. 7 forceps	e.g. Fine Science Tools	91197-00
perforated spoon	e.g. Fine Science Tools	10370-19	optional, for transfer of heart tissue
Trypan blue	e.g. Gibco	15250-061	live cell staining
Neubauer hemocytometer	e.g. Prosource Scientific	3500	alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems
50 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	14-432-23
15 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	05-527-90
20 ml syringe	e.g. BD Medical	14-820-19
10 ml serological pipette	e.g. Falcon	357551
30 mm cell culture dish	e.g. Nunc	153066	for standard culture of cardiomyocytes
30 mm cell culture dish, glass bottom	MatTek	P35G-0-10-C	for live cell imaging with inverted microscope
10 cm cell culture dish	e.g. Nunc	172958	for preplating
Escort III	Sigma	L3037	for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000
Lipofectamine 2000	Life Technologies, Invitrogen	52887	substitute for Escort III
			Buffers and media: Isolation medium (filter sterilize) 20 mM BDM 0.0125% trypsin in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+) Digestion medium (filter sterilize) 20 mM BDM 1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix in L15 medium Plating medium 65% DMEM high glucose 19% M-199 10% horse serum 5% fetal calf serum 1% penicillin/streptomycin Maintenance medium 78% DMEM high glucose 17% M-199 4% horse serum 1% penicillin/streptomycin optional: 1 μM AraC 1 μM isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine The plating and maintenance medium can be stored at 4 °C for up to 6 months.