Isolatie en cultuur van de Neonatale Mouse Cardiomyocytes

Summary

Primaire muis cardiomyocytkweken is een van de cruciale instrumenten voor het onderzoek myofibrillar inrichting en functie. Het volgende protocol beschrijft de isolatie en de cultuur van primaire cardiomyocyten van neonatale muis harten. De resulterende cardiomyocytkweken kunnen vervolgens worden gebruikt voor een verscheidenheid van biomechanische, biochemische en celbiologische assays.

Abstract

Gekweekte neonatale hartspiercellen al lang gebruikt om myofibrillogenesis en myofibrillar functies te bestuderen. Gekweekte hartspiercellen zorgen voor een gemakkelijke onderzoek en manipulatie van biochemische pathways, en hun effect op de biomechanische eigenschappen van spontaan slaan hartspiercellen.

De volgende 2-daagse protocol beschrijft de isolatie en de cultuur van neonatale muis hartspiercellen. We laten zien hoe je de harten gemakkelijk ontleden van pasgeborenen, distantiëren het hartweefsel en verrijken van hartspiercellen van de cardiale cel-populatie. We bespreken het gebruik van verschillende enzym mixen voor cel-dissociatie, en hun effecten op cel-levensvatbaarheid. De geïsoleerde cardiomyocyten kunnen vervolgens worden gebruikt voor een verscheidenheid van morfologische, elektrofysiologische, biochemische, celbiologische en biomechanische testen. We geoptimaliseerd het protocol voor robuustheid en reproduceerbaarheid, door het gebruik van enige commercieel beschikbare oplossingen en enzym mengt die show weinig veel-te-veel variatie. We richten ook vaak problemen met de het kweken van hartspiercellen en bieden een verscheidenheid aan mogelijkheden voor het optimaliseren van isolatie en kweekomstandigheden.

Introduction

De vroegste verslagen voor de succesvolle dissociatie en cultuur van knaagdieren hartcellen dateert uit de jaren 1960 ^1,2. Zelfs dan, Harary en Farley gemerkt dat gekweekte hartspiercellen "kan een uniek systeem voor de studie van de eisen van de periodieke contractiliteit bieden [en kan] een middel van het bepalen van de bijdrage van de verschillende metabole routes voor de [kloppende] proces". Hoewel Harary en Farley geïsoleerde en gekweekte hartspiercellen van jonge ratten, en het oorspronkelijke protocol is aangepast en gewijzigd door veel wetenschappers door de jaren heen, heeft de algemene isolatie en het kweken procedure niet sterk veranderd. Echter beter enzymen ^3, standaardoplossingen ^4,5, en de toevoeging van de omkeerbare kanaal en myosine ATPase inhibitor BDM cellen beschermen tijdens de isolatieprocedure ^6-9 aanzienlijk verbeterde cel-opbrengst en levensvatbaarheid.

Volwassen vs neonatale cardiomyocyten

Hartspiercellen geïsoleerd en gekweekt uit pasgeboren muizen of ratten hebben een aantal voordelen ten opzichte van culturen van volwassen hartspiercellen. Plaats de isolatieprocedure voor neonatale muis of rat hearts is gemakkelijker en goedkoper in vergelijking met de isolatie van cardiomyocyten van volwassen muis of rat ^10. Neonatale cardiomyocyten zijn veel minder gevoelig voor herintroductie in een calcium-bevattende medium na dissociatie, aanzienlijke verhoging van cel-opbrengst. Een ander groot voordeel is dat neonatale muis hartspiercellen ondergaan een snellere dedifferentiation – redifferentiatie cyclus die meestal resulteert in een spontaan verslaan cellen 20 uur na plating, terwijl volwassen hartspiercellen vergen doorgaans pacing om contractie te induceren. Neonatale cardiomyocyten zijn ook gemakkelijker transfecteerbare met liposomaal transfectiewerkwijzen, terwijl volwassen hartspiercellen vereisen virale vectoren voor succesvolle oplevering van transgeen DNA. In tegenstelling tot neonatale cardiomyocytens, de cultuur van volwassen knaagdieren hartspiercellen ^11-13 zorgt voor onderzoeken van myofibrillair degradatie en uiteindelijk herstel van het contractiele apparaat. Deze karakteristieke morfologische veranderingen in volwassen hartspiercellen plaatsvinden over een periode van 1-2 weken. De dedifferentiatie – redifferentiatie gaat gepaard met reexpression van het foetale genprogramma, waardoor pathologische veranderingen waargenomen in menselijke cardiomyopathieën ¹⁴ nabootsen. Een ander voordeel van volwassen hartspiercellen ratten via kweek van neonatale cardiomyocyten is de mogelijkheid om kweek deze cellen voor langere tijd.

Rat vs muis hartspiercellen

De isolatie en de cultuur van de rat neonatale cardiomyocyten heeft een aantal voordelen ten opzichte van dat van de muis neonatale hartspiercellen, met inbegrip van hogere opbrengsten van levensvatbare cellen en verhoogde transfectie tarieven. De brede gebruik van genetisch gemodificeerde muismodellen voor hartaandoeningen (bijv. </ Em> de spier lim eiwit knockout muis als model voor uitgezette cardiomyopathie ¹⁵⁾ heeft geleid tot de aanpassing van de isolatie procedure voor cardiomyocyten afgeleid van pasgeboren muizen. Hoewel de protocollen neonatale ratten en muizen cardiomyocyten isoleren bijna identiek moet zorgvuldiger worden genomen bij de keuze van een geschikt enzym mix voor de laatste. Inderdaad, neonatale muis hartspiercellen algemeen gevoeliger voor overdigestion, resulterend in een verminderde cel-opbrengst en levensvatbaarheid. Bovendien moet de beplating dichtheid aangepast, omdat cardiomyocyten afgeleid van neonatale muizen zijn iets kleiner dan cellen uit neonatale rat hearts.

Bij veel toepassingen voor het onderzoeken van morfologische, elektrofysiologische, biochemische, celbiologische en biomechanische parameters, alsmede voor het proces van myofibrillogenesis zijn gekweekte neonatale cardiomyocyten een van de meest veelzijdige systemen voor de studie van gewordencardiale celfuncties in vitro. De eerste stap naar een succesvolle test is echter afhankelijk van een gemakkelijke en betrouwbare methode voor neonatale muis hartspiercellen isoleren. Ons protocol haalt zijn methodologie uit vele bronnen en werd geoptimaliseerd voor reproduceerbaarheid en robuustheid. We bespreken factoren cardiomyocyt-opbrengst en levensvatbaarheid beïnvloeden, en bieden een verscheidenheid aan mogelijkheden voor het optimaliseren van isolatie en kweekomstandigheden.

Protocol

De volgende procedure beschrijft een tweedaags protocol 16,17 voor de isolatie en de cultuur van neonatale muis hartspiercellen. Alle oplossingen zijn steriel of steriel gefiltreerd. Alle instrumenten worden gesteriliseerd door oppervlakte sterilisatie met 75% ethanol. Behalve de eerste weefselextractie, worden alle stappen uitgevoerd in een steriele laminaire stroming celkweek kap. Dit protocol is bestemd voor het isoleren van neonatale muisharten 1-2 nest (s) – ongeveer 5-14 pups, maar kan worden aangepast …

Representative Results

Met behulp van dit protocol, geïsoleerd we harten van 8 een dag oud pasgeboren muizen (figuren 1A, 1B, aanvullende Movie S1). Na wassen en fijnhakken de harten met een schaar (Figuren 1C-1F), werden weefselfragmenten voorverteerd in isolatiemedium een nacht bij 4 ° C onder zacht schudden. Na predigestion (figuur 1G), overgedragen we het weefsel fragmenten in vers digestiemedium en gedurende het weefsel fragmenten gedurende 20 minuten bij 37 ° C onder zacht schudden. …

Discussion

Het gebruik van diermodellen om hartziekten te bestuderen is standaard geworden in het cardiovasculair onderzoek. Dichter biochemische karakterisering van deze modellen (dwz het bestuderen van directe reacties van hartcellen aan biochemische of biomechanische stimuli) vereist meestal de isolatie van hart weefsels of hartspiercellen. Onderzoeken naar fysiologische reacties van het hart ex vivo (bv. om acetylcholine ^40, of in ischemie-reperfusie scenario ⁴¹⁾ over het algemeen gebrui…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8	Sigma	B-0753	prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.
Collagenase/Dispase	Roche	10269638001	can be substituted with collagenase type II from Worthington
Collagenase type II3	Worthington	CLS-2	substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA	e.g. cellgro	25-053-CI
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS	e.g. cellgro	30-002-Cl
1x PBS (without Ca2+, Mg2+)	e,g, cellgro	21-040-CV
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4	e.g. cellgro	21-022-CV
DMEM high glucose	e.g. cellgro	10-013-CV
M-199	e.g. cellgro	10-060-CV
fetal bovine serum	e.g. cellgro	35-011-CV	cell-culture grade
horse serum	e.g. cellgro	35-030-CV	cell-culture grade
Leibovitz L-155	e.g. cellgro	10-045-CV
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)	Sigma	C-6645	proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C
phenylephrine	Sigma	P-6126	chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
isoproterenol hydrochloride	Sigma	I-6501	chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
0.1% collagen solution	Sigma	C-8919	extracellular matrix for coating
3 mg/ml collagen type 1 solution	Advanced BioMatrix	5005-B	alternative to Sigma collagen solution
cell strainer	e.g. Fisherbrand	22363548	appropriate filter size:40 μm-100 μm
syringe filter 0.2 μm	e.g. Fisherbrand	09-719C	for sterile filtration of digestion medium
straight scissors	e.g. Fine Sciences Tools	91460-11
curved scissors	e.g. Fine Science Tools	91461-11
Dumont No. 7 forceps	e.g. Fine Science Tools	91197-00
perforated spoon	e.g. Fine Science Tools	10370-19	optional, for transfer of heart tissue
Trypan blue	e.g. Gibco	15250-061	live cell staining
Neubauer hemocytometer	e.g. Prosource Scientific	3500	alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems
50 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	14-432-23
15 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	05-527-90
20 ml syringe	e.g. BD Medical	14-820-19
10 ml serological pipette	e.g. Falcon	357551
30 mm cell culture dish	e.g. Nunc	153066	for standard culture of cardiomyocytes
30 mm cell culture dish, glass bottom	MatTek	P35G-0-10-C	for live cell imaging with inverted microscope
10 cm cell culture dish	e.g. Nunc	172958	for preplating
Escort III	Sigma	L3037	for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000
Lipofectamine 2000	Life Technologies, Invitrogen	52887	substitute for Escort III
			Buffers and media: Isolation medium (filter sterilize) 20 mM BDM 0.0125% trypsin in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+) Digestion medium (filter sterilize) 20 mM BDM 1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix in L15 medium Plating medium 65% DMEM high glucose 19% M-199 10% horse serum 5% fetal calf serum 1% penicillin/streptomycin Maintenance medium 78% DMEM high glucose 17% M-199 4% horse serum 1% penicillin/streptomycin optional: 1 μM AraC 1 μM isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine The plating and maintenance medium can be stored at 4 °C for up to 6 months.